基于氨基酸代谢组学研究苏格木勒抗失眠作用机理的方法技术

基于氨基酸代谢组学研究苏格木勒抗失眠作用机理的方法是应用GC‑MS法对苏格木勒灌胃前后PCPA失眠模型大鼠大脑各组织中氨基酸代谢组进行分析，标准图谱库指认内源性化合物，采用PCA和PLS‑DA模式分析大脑各部位代谢物谱的变化并鉴定相关代谢标志物；应用LC‑MS开展靶向代谢组学研究，考察脑组织中5‑羟基色胺、GABA、Glu等神经递质及相关代谢物含量变化；通过寻找临床大鼠脑组织样本中与苏格木勒疗效相关的差异代谢物及其代谢通路，明确苏格木勒抗失眠作用机制及作用位点；本发明专利技术首次应用代谢组学研究手段，初步探明苏格木勒通过神经递质系统调控睡眠‑觉醒节律的作用机理。

Study on the anti insomnia mechanism of sugmuller based on amino acid metabonomics

【技术实现步骤摘要】
基于氨基酸代谢组学研究苏格木勒抗失眠作用机理的方法
本专利技术属于中医药技术和代谢组学技术的交叉
，具体地说是基于氨基酸代谢组学研究苏格木勒抗失眠作用机理的方法。
技术介绍
睡眠约占正常人每天三分之一的时间,是维持人体正常生命活动的一个重要的生理过程。近年来,随着经济的快速发展,生活节奏不断加快,职业及环境压力越来越大，失眠的发生率也不断上升，且呈年轻化的趋势也越来越明显，严重影响了人们的正常的工作、生活和健康。失眠已经成为神经内科门诊中常见病、多发病，以难以入睡、易醒、多梦、早醒、醒后不易再睡或醒后不适等为临床表现。苏格木勒-3汤是蒙医传统药方,出自蒙医经典著作《四部医典》,《蒙医百科全书》、《蒙药方剂学》均有记载。本研究根据查干夫教授改良后传统配方，在原方白豆蔻15g，白苣胜10g，荜菝5g的基础上，添加炒酸枣仁15g。主治失眠，为安神的良药。方中酸枣仁味甘，性平，白豆蔻味苦，辛，性温，为镇赫依主药；白苣胜味甘、性平，为镇赫依辅助药；加配调理体素药荜菝，四药合用，相互协调，成为赫依病之专药。睡眠是一个非常复杂的过程，中枢神经递质代谢异常及相应受体功能改变是目前对该病发病机制及治疗的研究热点之一。单胺类神经递质5-羟色胺(5-HT)、去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)和氨基酸类神经递质γ-氨基丁酸(GABA)、谷氨酸(G1u)都参与了睡眠机制的调节，任何一种递质含量的变化及不同递质间比例的失调都会影响它们之间的平衡关系而导致失眠。5-HT是引起睡眠发生的重要化学物质,其神经元主要位于低位脑干近中线区的中缝核内，失眠患者普遍伴随5-HT含量的降低。艾司米氮平作为H1/5-HT2A受体拮抗剂可以显著的改善入睡困难，延长睡眠时间，酸枣仁汤能与5-HT及GABA受体结合，高剂量酸枣仁汤(4g/kg/2ml)显著增加非眼动睡眠(NREMS)时间，加入5-HT受体拮抗剂可消除NREMS时间的增长。DA是NE的前体物质，是下丘脑和脑垂体腺中的一种关键神经递质，属于兴奋性神经递质，若刺激使其含量增加，则动物觉醒增加，睡眠减少，NE在不同部位有着显著差异的特定作用。睡眠剥夺模型下丘脑、脑干内5-HT含量明显下降，NE、DA含量明显升高。GABA是中枢神经系统中最重要的抑制性递质,中枢神经系统中大约有20％-40％的中枢突触主要是以GABA作为神经递质。睡眠剥夺动物模型与空白组相比，大鼠脑内下丘脑、脑干GABA含量下降，Glu含量增加。多项研究结果也表明药物可通过改变神经递质含量改善睡眠,从天麻中分离得到的腺嘌呤苷类似物B2能通过增加大鼠大脑皮层和下丘脑GAD酶活性和GABA浓度，缩短睡眠潜伏期延长NREM睡眠。目前常见的抗失眠药物为苯二氮卓类药物和非“Z”抗失眠药物，其作用靶点是GABA受体，存在药物起效慢，副作用大等特点，目前失眠治疗存在较大的挑战，究其原因，与失眠病理生理机制尚不明确存在紧密相关。氨基酸是蛋白质构成的基本单位，也是重要神经递质的必要前体分子，参与信号转导，免疫调节以及基因表达过程等。此外，有研究显示循环色氨酸或苯丙氨酸快速耗竭可诱导有抑郁症家族史的健康人群以及处于缓解期的抑郁症患者出现短暂的抑郁样行为。抗抑郁药物辅以特定氨基酸(如甲硫氨酸)作为辅剂进行抗抑郁治疗较抗抑郁药单药治疗果更为明显。氨基酸代谢检测分析将有助于我们从代谢水平进一步了解失眠、抑郁症等精神疾病的病理生理过程及其发病机制。代谢组学(Metabolomics)是系统生物学研究中又一代表性研究技术，是一门以机体内小分子代谢物变化特点为重要研究内容的新兴学科。这些小分子代谢物可以大致分为氨基酸，有机酸，脂酸以及糖类等。小分子代谢产物作为代谢通路的最终产物，其表达水平与代谢通路中对应酶的活性以及这些酶的效应物密切相关，与人体的病理生理状态紧密联系。因此，代谢组学是探索疾病病理生理机制，发现疾病生物标志物的一种新兴技术方法。气相色谱-质谱法(GC-MS)作为其中一种分析技术，具有高通量、高灵敏度、高分离与解析能力且自带结构鉴定谱库的特点，被广泛应用于代谢组学研究领域。生物体内的代谢物，如氨基酸、脂肪酸、胺类、糖类和核苷酸类物质，具有极性强、挥发性低的共同特征，且容易被色谱柱吸附，不适合直接进行GC-MS分析。方法主要有肟化-硅烷化衍生法和氯甲酸酯衍生法。相比硅烷化衍生，氯甲酸酯衍生法对氨基酸、有机酸等代谢物有更高的衍生效率和更好的衍生稳定性。应用GC-MS代谢组学方法检测血浆代谢物,分别使用S-Plot和方差同步主成分分析静态(CUMS模型复制终点)和动态(CUMS模型复制全过程)代谢组数据。结果显示,静态代谢组学分析发现丙酸、D-阿洛糖和亚麻酸3个差异代谢物；动态代谢组学分析获得丙酸、D-阿洛糖、肌醇、丁酸等7个差异代谢物。采用基于GC-MS的代谢组学研究伴有抑郁症乙肝患者尿液代谢物差异分析，发现6种化合物与对照组有显著性差异，提示此方法可用患有抑郁症的乙肝患者临床标记物的筛查。综上所述，失眠已经成为神经内科门诊中常见病、多发病，临床疗效和小鼠药效学研究证实了苏格木勒-4抗失眠活性。然而，失眠的发病机理及治疗机制均未得到测定阐明，因此，本专利技术采用基于GC-MS的非靶向代谢组学和基于LC-MS的靶向代谢组学研究苏格木勒-4对大鼠脑内与神经递质相关的代谢通路影响，初步探明其作用机制及靶点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足之处，提供能够在临床疗效和小鼠药效学研究证实了苏格木勒-4抗失眠活性的基础上，测定阐明失眠的发病机理及治疗机制的基于氨基酸代谢组学研究苏格木勒抗失眠作用机理的方法；基于氨基酸代谢组学研究苏格木勒抗失眠作用机理的方法是应用衍生化GC-MS法对苏格木勒灌胃前后PCPA失眠模型大鼠大脑各组织中氨基酸代谢组进行分析，标准图谱库指认内源性化合物，采用PCA和PLS-DA模式分析大脑各部位代谢物谱的变化并鉴定相关代谢标志物；应用LC-MS开展靶向代谢组学研究，考察脑组织中5-羟基色胺、GABA、Glu等神经递质及相关代谢物含量变化；通过本专利技术寻找临床大鼠脑组织样本中与苏格木勒-4疗效相关的差异代谢物及其代谢通路，探讨苏格木勒-4抗失眠作用机理及作用位点。为了实现本专利技术的目的，我们将采用如下所述的技术方案加以实施。基于氨基酸代谢组学研究苏格木勒抗失眠作用机理的方法，其特征在于：所述方法包括如下所述的步骤：一、构建PCPA失眠大鼠模型；二、采用氯甲酸酯衍生法对大鼠脑组织代谢物进行衍生，优化测定条件；三、采用GC-MS分析，NIST数据库检索进行峰识别，面积归一化处理；四、使用主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)进行数据分析；五、采用Metaboanlayst3.0和KEGG数据库模拟剖析代谢通路，确定失眠的潜在生物标志物和相关代谢通路；六、采用LC-MS/MS多反应监测模式测定给药后大鼠脑皮层、脑干、下丘脑、海马组织中5-羟基色胺、5-羟基吲哚乙酸、多巴胺、去甲肾上腺素、牛磺酸、γ-氨基丁酸、谷氨酸神经递质和相关前体及代谢物含量，明本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于氨基酸代谢组学研究苏格木勒抗失眠作用机理的方法，其特征在于：所述方法包括如下所述的步骤：/n一、构建PCPA失眠大鼠模型；/n二、采用氯甲酸酯衍生法对大鼠脑组织代谢物进行衍生，优化测定条件；/n三、采用GC-MS分析，NIST数据库检索进行峰识别，面积归一化处理；/n四、使用主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)进行数据分析；/n五、采用Metaboanlayst3.0和KEGG数据库模拟剖析代谢通路，确定失眠的潜在生物标志物和相关代谢通路；/n六、采用LC-MS/MS多反应监测模式测定给药后大鼠脑皮层、脑干、下丘脑、海马组织中5-羟基色胺、5-羟基吲哚乙酸、多巴胺、去甲肾上腺素、牛磺酸、γ-氨基丁酸、谷氨酸神经递质和相关前体及代谢物含量，明确苏格木勒-4对脑内神经递质合成代谢的作用位点，阐明苏格木勒-4抗失眠作用机理。/n

【技术特征摘要】
1.基于氨基酸代谢组学研究苏格木勒抗失眠作用机理的方法，其特征在于：所述方法包括如下所述的步骤：
一、构建PCPA失眠大鼠模型；
二、采用氯甲酸酯衍生法对大鼠脑组织代谢物进行衍生，优化测定条件；
三、采用GC-MS分析，NIST数据库检索进行峰识别，面积归一化处理；
四、使用主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)进行数据分析；
五、采用Metaboanlayst3.0和KEGG数据库模拟剖析代谢通路，确定失眠的潜在生物标志物和相关代谢通路；
六、采用LC-MS/MS多反应监测模式测定给药后大鼠脑皮层、脑干、下丘脑、海马组织中5-羟基色胺、5-羟基吲哚乙酸、多巴胺、去甲肾上腺素、牛磺酸、γ-氨基丁酸、谷氨酸神经递质和相关前体及代谢物含量，明确苏格木勒-4对脑内神经递质合成代谢的作用位点，阐明苏格木勒-4抗失眠作用机理。


2.根据权利要求1所述的基于氨基酸代谢组学研究苏格木勒抗失眠作用机理的方法，其特征在于：在所述的步骤一中，所述PCPA失眠大鼠模型的构建方法是将大鼠按体重随机分为正常对照组、模型对照组、蒙药组和安神补脑口服液组，每组10只；除正常对照组外，其余3组大鼠于每日上午8:00腹腔注射PCPA混悬液lml/100g，每日1次,连续注射2日，正常对照组腹腔注射同体积的弱碱性生理盐水；于第一次腹腔注射24-28h后，动物出现昼夜节律消失，白天也活动不停，表明模型复制成功；大鼠腹腔注射PCPA二日，模型复制成功后，于第三日开始每天早8:00灌胃给药，每日一次；蒙药组以高中低剂量组给予灌胃；模型对照组以相同体积灌胃给予安神补脑口服液；正常对照组和模型对照组灌胃给予同体积的蒸馏水；连续灌胃给药7天，于末次给药60min后对大鼠进行脱颈椎处理。


3.根据权利要求1所述的基于氨基酸代谢组学研究苏格木勒抗失眠作用机理的方法，其特征在于：在所述的步骤二中，所述的衍生包括如下所述的步骤：
一、将大鼠断头取脑，在冰盘上分离皮层、海马、脑干和下丘脑，将各组织沿中轴线切割，各组织左右两侧于-80℃冰箱中分别保存；
二、从-80℃冰箱中取出组织，置于匀浆仪中，加入4倍水，匀浆30s至无组织碎块，取200μL匀浆液置EP管中，加入125μL氯仿，375μL甲醇，冰浴超声10min，取上清液300μL于进样小瓶中，氮气吹干；
三、残渣加入30μL(15mg·mL-1)盐酸甲氧胺吡啶溶液，70℃反应1h，再加入50μLMSTFA(含1％TMCS)，40℃反应90min；
四、最后加入500μL正庚烷(内含0.1mg·mL-1二十四烷)，涡旋1min，然后进行GC-MS分析。


4.根据权利要求1所述的基于氨基酸代谢组学研究苏格木勒抗失眠作用机理的方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：田继兰，
申请(专利权)人：田继兰，
类型：发明
国别省市：内蒙;15