用于在肝中表达感兴趣的蛋白的平台制造技术

本说明书涉及通过对肝进行人工操纵来表达感兴趣的蛋白的平台，更具体而言，涉及通过如下方式来减轻或治疗遗传性疾病或者改善机体功能的平台：将能够具有正常功能和表达的转基因(例如治疗性基因)插入高表达分泌型基因中代替功能或表达异常的疾病基因，并诱导该转基因表达。高表达分泌型基因包括HP基因或APOC3基因。转基因包括借助肝细胞基因组中的启动子以高水平表达并被分泌至细胞外的转基因。

A platform for expression of proteins of interest in the liver

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于在肝中表达感兴趣的蛋白的平台
本专利技术涉及通过对肝进行人工操纵或修饰来表达感兴趣的蛋白的平台。更具体而言，本专利技术涉及使用引导核酸和/或编辑蛋白，通过诱导能够正常发挥功能或表达的转基因(例如治疗性基因)的表达来代替功能或表达异常的疾病基因来减轻或治疗遗传性紊乱或改善机体功能的平台。
技术介绍
基因治疗在人类工程的新时代具有巨大的潜力。基因治疗包括基因组编辑技术，例如基因破坏、基因修饰和转基因的插入(所述转基因可通过与其融合的特定外源启动子或在基因组插入位点处发现的内源启动子进行调节)。如今，难治性血友病或溶酶体贮积病没有合适的治疗剂，主要用于治疗的是使用酶或蛋白替代物的替代疗法，但该疗法不是根治性疗法。此外，在临床试验中正在进行使用AAV表达治疗性基因的方法，但是也可以预期这些方法仅在AAV表达时有效，因此它们不能是根治且长期的治疗方法。因此，存在对用于更长久且更有效治疗的治疗平台的需求，所述平台通过将真正的治疗性基因插入患者的基因组中以使得能够永久性表达。此类治疗平台与通过治疗剂的暂时和重复给予的现有治疗方法不同，并且可以使用用于基因修正的有效的靶标特异性可编程核酸酶开发高效的治疗平台，以将治疗性基因插入患者的基因组中。为此原因，本专利技术人旨在开发能够使用靶标特异性可编程核酸酶来持续表达感兴趣的基因的治疗平台。特别是，为了高效率，通过确定在器官或组织(例如肝)中高表达的基因的位点作为感兴趣的基因的插入位点，完成了有效的平台。
技术实现思路
技术问题本专利技术旨在提供使用CRISPR-Cas系统在肝细胞中表达感兴趣的蛋白的平台。本专利技术还旨在提供用于表达感兴趣的蛋白的组合物及其各种用途，所述组合物包含感兴趣的蛋白或编码所述感兴趣的蛋白的序列并使用CRISPR-Cas系统。本专利技术还旨在提供使用CRISPR-Cas系统来表达感兴趣的蛋白的细胞及制备所述细胞的方法。本专利技术还旨在提供使用CRISPR-Cas系统在肝细胞中表达感兴趣的蛋白的方法。本专利技术还旨在提供对遗传性紊乱进行治疗的方法，所述方法包括向待治疗的受试者给予用于在肝细胞中表达感兴趣的蛋白的组合物。本专利技术还涉及提供引导核酸和编辑蛋白，所述引导核酸和编辑蛋白能够用于操纵相应的靶基因，以在肝细胞中表达感兴趣的蛋白。技术方案为了解决上述问题，本专利技术提供了在肝细胞中表达感兴趣的蛋白的平台。更具体而言，本专利技术提供了用于通过如下方式来改善机体功能和治疗遗传疾病的平台：使用CRISPR-Cas系统将编码感兴趣的蛋白的基因插入靶基因中来持续地以高水平表达该蛋白；还提供经人工修饰的细胞、器官或组织。本文所使用的“肝生物工厂平台(Liverbiofactoryplatform)”是能够通过将特定转基因插入肝细胞来持续表达感兴趣的蛋白的系统，所述系统包括其中直接或间接涉及的所有组合物、方法和用途。在一个实例中，可将人工插入的转基因能整合在肝细胞中高表达分泌型基因内。高表达分泌型基因为选自于由如下基因所组成的组的至少一种：存在于肝细胞基因组中的ALB基因、FTL基因、FTH1基因、ACTB基因、HP基因、APOC3基因、SOD2基因、ORM1基因和F9基因。与插入前相比转基因表达较高，或者转基因在肝细胞中新表达。另外，本文公开的公开内容涉及包含靶标特异性可编程核酸酶的用于在肝细胞中表达感兴趣的蛋白的组合物；具体而言，涉及用于操纵基因的组合物，所述组合物包含用于将转基因插入高表达分泌型基因的可编程核酸酶，所述高表达分泌型基因是选自高表达分泌型基因的组中的一个或多个基因。在一个实例中，本专利技术提供了用于表达感兴趣的蛋白的组合物，所述组合物包含：引导核酸，所述引导核酸与选自在肝中表达的高表达分泌型基因的组中的一个或多个基因的靶序列相对应；编辑蛋白或编码编辑蛋白的核酸；以及供体(donor)，所述供体包含编码感兴趣的蛋白的核苷酸序列。“高表达分泌型基因”是指在肝细胞中以预定水平或更高水平表达的基因，所述基因在肝细胞中高度表达，从而使得表达产物被分泌出肝细胞。高表达分泌型基因存在于如下位点：在所述位点中，高表达分泌型基因能在肝细胞基因组中高水平持续表达；并且，可具有安全港位点(safeharboursite)的功能。高表达分泌型基因可以是选自于由如下所组成的组中的至少一种：ALB基因、FTL基因、FTH1基因、ACTB基因、HP基因、APOC3基因、SOD2基因、ORM1基因、AAVS1基因、Rosa基因、HPRT基因和CCR5基因。高表达分泌型基因可优选为HP基因或APOC3基因。可编程核酸酶是指人工工程化的核酸酶，在实例中，可编程核酸酶为选自于由如下核酸酶所组成的组中的至少一种：成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)-CRISPR相关蛋白(Cas)系统、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)。关于核苷酸序列中的修饰，可通过使用CRISPR-Cas系统不受限制地进行人工操纵。“CRISPR-Cas系统”是指由识别和结合至感兴趣的基因的序列的引导核酸与切割靶基因的编辑蛋白之间的相互作用形成的系统，CRISPR-Cas系统包含引导核酸和编辑蛋白。CRISPR-Cas系统可对靶标进行修饰。靶标可以是靶核酸、基因、染色体或蛋白。编辑蛋白为选自于由如下蛋白所组成的组中的一种或多种蛋白：酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)衍生而来的Cas9蛋白、空肠弯曲杆菌(Campylobacterjejuni)衍生而来的Cas9蛋白、嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)衍生而来的Cas9蛋白、金黄色葡萄球菌(Streptocuccusaureus)衍生而来的Cas9蛋白、脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis)衍生而来的Cas9蛋白、以及Cpf1蛋白，或编码所述蛋白的核酸。在实例中，编辑蛋白可以是酿脓链球菌衍生而来的Cas9蛋白或空肠弯曲杆菌衍生而来的Cas9蛋白。靶序列可以是位于高表达分泌型基因序列的外显子区的连续的10bp-25bp的核苷酸序列。靶序列可以是位于高表达分泌型基因序列的内含子区的连续的10bp-25bp的核苷酸序列。靶序列可为选自于由SEQIDNO:1-SEQIDNO:348所组成的组中的至少一种。指导核酸能够与选自高表达分泌型基因的组中的至少一种基因的核苷酸序列的一部分形成互补结合。引导核酸可以包含与靶序列0-5个核苷酸、0-4个核苷酸、0-3个核苷酸、或0-2个核苷酸的错配。在一个实施方式中，本文公开的公开内容包含针对高表达分泌型基因的引导核酸，所述高表达分泌型基因为选自于由如下基因所组成的组中的至少一种：ALB基因、FTL基因、FTH1基因、ACTB基因、HP基因、APOC3基因、SOD2基因、ORM1基因、AAVS1基因、Rosa基因、HPRT基因和CCR5基因。...

【技术保护点】
1.一种用于表达人工插入肝细胞基因组中的转基因的肝生物工厂平台(LBP)系统，/n其中，所述转基因位于高表达分泌型基因的序列中，/n其中，所述高表达分泌型基因为选自于由肝细胞基因组中存在的F9基因、ALB基因、FTL基因、FTH1基因、ACT基因、HP基因、APOC3基因、SOD2基因和ORM1基因所组成的组中的至少一种，/n其中，所述转基因与插入前相比表达较高，或者所述转基因在肝细胞中新表达。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170615 US 62/520,103;20180426 US 62/662,9071.一种用于表达人工插入肝细胞基因组中的转基因的肝生物工厂平台(LBP)系统，
其中，所述转基因位于高表达分泌型基因的序列中，
其中，所述高表达分泌型基因为选自于由肝细胞基因组中存在的F9基因、ALB基因、FTL基因、FTH1基因、ACT基因、HP基因、APOC3基因、SOD2基因和ORM1基因所组成的组中的至少一种，
其中，所述转基因与插入前相比表达较高，或者所述转基因在肝细胞中新表达。


2.如权利要求1所述的LBP系统，其中，所述高表达分泌型基因为HP基因和APOC3基因中的至少一种。


3.如权利要求1所述的LBP系统，其中，所述转基因插入至所述高表达分泌型基因的内含子和外显子的至少一部分中。


4.如权利要求1所述的LBP系统，其中，由肝细胞基因组中原始存在的启动子表达所述转基因。


5.如权利要求1所述的LBP系统，其中，所述转基因为F9基因。


6.如权利要求1所述的LBP系统，其中，通过所述转基因的表达产生的蛋白被分泌出肝细胞。


7.一种用于修饰基因以表达人工插入肝细胞基因组中的转基因的组合物，所述组合物包含：
用于将所述转基因整合至高表达分泌型基因中的可编程核酸酶；
其中，所述高表达分泌型基因为选自于由FTL基因、FTH1基因、ACTB基因、HP基因、APOC3基因、SOD2基因、ORM1基因和F9基因所组成的组中的至少一种。


8.如权利要求7所述的组合物，所述可编程核酸酶为选自于由如下所组成的组中的至少一种：成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)-CRISPR相关蛋白(Cas)系统、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)。


9.如权利要求7所述的组合物，所述高表达分泌型基因为HP基因和APOC3基因中的至少一种。


10.如权利要求7所述的组合物，其中，所述转基因为F9基因。


11.一种用于修饰基因以表达人工插入肝细胞基因组中的转基因的组合物，所述组合物包含：
引导核酸，其中，所述引导核酸针对选自肝细胞基因组中存在的高表达分泌型基因中的至少一种基因的靶序列；
编辑蛋白或编码所述编辑蛋白的核酸；以及
包含所述转基因的供体。


12.如权利要求11所述的组合物，其中，所述编辑蛋白为选自于由如下蛋白所组成的组中的至少一种：酿脓链球菌衍生而来的Cas9蛋白、空肠弯曲杆菌衍生而来的Cas9蛋白、嗜热链球菌衍生而来的Cas9蛋白、金黄色葡萄球菌衍生而来的Cas9蛋白、脑膜炎奈瑟菌衍生而来的Cas9蛋白和Cpf1蛋白。


13.如权利要求11所述的组合物，其中，所述靶序列位于所述高表达分泌型基因序列中的外显子、内含子、5'-UTR、3'-UTR和增强子的至少一部分中。


14.如权利要求11所述的组合物，其中，所述靶序列位于所述高表达分泌型基因序列中的外显子和内含子的至少一部分中。


15.如权利要求11所述的组合物，其中，所述靶序列为选自于由SEQIDNO:1-SEQIDNO:348所组成的组中的至少一种。


16.如权利要求11所述的组合物，其中，所述高表达分泌型基因为HP基因和APOC3基因中的至少一种。


17.如权利要求11所述的组合物，其中，所述引导核酸包含对应于位于所述高表达分泌型基因中的靶序列的引导结构域；
其中，所述引导结构域包含与所述靶序列错配的0-5个核苷酸。


18.如权利要求11所述的组合物，其中，所述引导核酸对应于HP或APOC3基因的核苷酸序列中的靶核酸，所述靶核酸选自于由SEQIDNO:1-SEQIDNO:348所组成的组。


19.如权利要求11所述的组合物，其中，所述引导核酸对应于选自于由SEQIDNO:1-SEQIDNO:11、SEQIDNO:37-SEQIDNO:51、SEQIDNO:154-SEQIDNO:167和SEQIDNO:168-SEQIDNO:182所组成的组中的靶序列。


20.如权利要求11所述的组合物，其中，所述引导核酸对应于选自于由SEQIDNO:1-SEQIDNO:40和SEQIDNO:154-SEQIDNO:167所组成的组中的靶序列；
其中，所述组合物进一步包含空肠弯曲杆菌衍生而来的Cas9蛋白或编码所述Cas9蛋白的核酸。


21.如权利要求11所述的组合物，其中，所述引导核酸对应于选自于由SEQIDNO:41-SEQIDNO:134和SEQIDNO:168-SEQIDNO:332所组成的组中的靶序列；
其中，所述组合物进一步包含酿脓链球菌衍生而来的Cas9蛋白或编码所述Cas9蛋白的核酸。


22.如权利要求11所述的组合物，其中，所述引导核酸对应于选自于由SEQIDNO:135-SEQIDNO:153和SEQIDNO:333-SEQIDNO:348所组成的组中的靶序列；
其中，所述组合物进一步包含金黄色葡萄球菌衍生而来的Cas9蛋白或编码所述Cas9蛋白的核酸。


23.如权利要求11所述的组合物，其中，所述转基因为F9基因。


24.如权利要求11所述的组合物，其中，以核苷酸序列的形式在至少一个载体中分别编码所述引导核酸、编辑蛋白和供体。


25.如权利要求11所述的组合物，其中，所述载体为病毒载体系统。


26.如权利要求25所述的组合物，其中，所述病毒载体为选自于由腺病毒、腺相关病毒(AAV)、痘苗病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒和慢病毒所组成的组中的至少一种。


27.一种引导核酸，其中，所述引导核酸对应于选自于由SEQIDNO:1-SEQIDNO:348所组成的组中的靶序列。


28.如权利要求27所述的引导核酸，其中，所述引导核酸对应于选自于由SEQIDNO:1-SEQIDNO:12、SEQIDNO:37-SEQIDNO:51、SEQIDNO:154-...

【专利技术属性】
技术研发人员：金奭中，宋东佑，李圭晙，李贞慜，金云起，
申请(专利权)人：株式会社图尔金，
类型：发明
国别省市：韩国;KR