一种基于家蚕二分浓核病毒的重组质粒及其构建方法技术

本发明专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种基于家蚕二分浓核病毒的重组质粒及其构建方法。本发明专利技术构建了一种携带标记基因eGFP的家蚕二分浓核病毒基因组VD2的重组表达质粒，所构建的重组质粒在不破坏家蚕二分浓核病毒VD2基因编码的前提下在加入eGFP基因的完整表达框，既不破坏家蚕二分浓核病毒VD2的编码基因，又增加分析的便捷性，避免了由于病毒基因编码框被破坏带来的实验阻力，另一方面，本发明专利技术以eGFP或RGP基因作为标记基因，能够较直观和便捷的判定转染及感染的成功与否，增加实验的便捷性。

A recombinant plasmid based on Bombyx mori dichotomous nuclear virus and its construction method

【技术实现步骤摘要】
一种基于家蚕二分浓核病毒的重组质粒及其构建方法
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种基于家蚕二分浓核病毒的重组质粒及其构建方法。
技术介绍
家蚕二分浓核病毒(Bombyxmoribidensovirus,BmBDV)是一种可以引发家蚕罹患类似昆虫浓核症的病原，BmBDV特异性感染家蚕中肠柱状上皮细胞能够引起幼虫致死性软化病。被该病毒感染的家蚕会引起空头下痢等症状且，感染病毒后的家蚕有厌食症状。该病毒与昆虫浓核病毒（Densovirus）有相似的病毒粒子特征和基因组结构。BmBDV为无囊膜的球状病毒粒子，直径约20~24nm，包含2个线性单链DNA分子，大小分别约6.5kb(VD1)和6kb(VD2)，VD1和VD2各自包装进病毒粒子，基因组末端具有反向末端重复序列。目前还没有一种体外培养细胞系可供BmBDV感染，由于BmBDV没有敏感细胞系，对于该病毒的研究限制在家蚕幼虫上，BmBDV的增殖与基因功能研究受到极大限制，病毒的入侵和复制机制、病毒和宿主的相互作用等方面还远未阐明。因此，构建稳定高效的能拯救BmBDV的反向遗传体系尤为重要。之前的研究中将重组质粒pVD1-NS1GFPf，pVD1-VP/GFP和pVD1-VPGFPf分别与pUC119-VD2质粒线性化共转染BmN细胞；重组质粒pVD2-mCP/GFP与pMD18T-VD1质粒线性化共转染BmN细胞；但是，GFP标记的引入破坏了BmBDV基因，不利于后续的研究。故构建一种既便于检测又不破坏病毒基因结构的家蚕二分浓核病毒基因组重组质粒，对于构建该病毒的反向遗传体系十分必要的。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种基于家蚕二分浓核病毒的重组质粒及其构建方法。本专利技术所提供的重组质粒在不破坏家蚕二分浓核病毒VD2编码基因完整性的前提下加入标记基因的完整表达框，增加BmBDV复制分析的便捷性。为了实现上述专利技术目的，本专利技术所采用的技术方案是：通过酶切酶连的方法将含有完整表达框的标记基因eGFP片段插入到VD2基因组的非编码区中。本专利技术提供一种基于家蚕二分浓核病毒的重组质粒，其包含有VD2完整基因组，含有杆状病毒BmNPV的ie1启动子和sv40终止子完整表达框的标记基因片段，所述的标记基因为eGFP基因或RGP基因。本专利技术还提供了一种基于家蚕二分浓核病毒的重组质粒构建方法，包括以下步骤：（1）构建包含VD2完整基因组的pUC-VD2/PmaCI质粒：（2）以步骤（1）中构建的pUC-VD2/PmaCI质粒为模板，设计引物序列F1和R1，F2和R2；以BmNPV和pFBDM质粒为模板构建得到pT-ie1-eGFP-sv40质粒，根据构建的pT-ie1-eGFP-sv40质粒设计引物序列F3和R3；（3）利用步骤（2）中设计的引物序列分别进行PCR扩增，以pUC-VD2/PmaCI为模板PCR扩增分别得到上游产物片段VD2-U和下游产物片段VD2-D；以pT-ie1-eGFP-sv40质粒为模板PCR扩增产物片段L-eGFP；（4）将步骤（3）中得到的产物片段酶切胶回收纯化，依次将酶切后的目的片段VD2-U，L-eGFP，VD2-D与pFBDM质粒载体连接得到重组质粒pFBDM-VD2eGFP。步骤（1）中所述的pUC-VD2/PmaCI质粒是在BmBDV的VD2基因末端序列5'GTGTGTGT前插入CAC三个核苷酸，在3'CACACACA前插入GTG三个核苷酸，将插入后的序列装配在pUC119质粒上形成。步骤（2）中所述的引物序列F1保留酶切位点NotI，引物序列R1保留酶切位点SalI，引物序列F2保留酶切位点StuI，引物序列R2保留酶切位点EcoRI；引物序列F3保留酶切位点SalI，引物序列R3保留酶切位点StuI。步骤（2）中所述F1的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，R1的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示，F2的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示，R2的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示，F3的核苷酸序列如SEQIDNO:6所示，R3的核苷酸序列如SEQIDNO:7所示。步骤（2）中所述的pT-ie1-eGFP-sv40质粒的核苷酸序列如SEQIDNO:5所示。步骤（2）中所述的pT-ie1-eGFP-sv40质粒是以BmNPV基因为模板扩增得到ie1启动子序列，以pFBDM质粒为模板扩增得到sv40终止子序列；将ie1启动子，eGFP与sv40终止子酶切酶连后形成。步骤（3）中所述上游产物片段VD2-U核苷酸序列如SEQIDNO:8所示，下游产物片段VD2-D核苷酸序列如SEQIDNO:9所示，L-eGFP核苷酸序列如SEQIDNO:10所示。在某一具体实施例中，本专利技术将构建的重组质粒pFBDM-VD2eGFP转化到大肠杆菌感受态细胞内，在含有抗生素的培养基中过夜培养；挑选平板上阳性菌斑，用质粒抽提试剂盒提取质粒DNA，得到重组质粒基因组。所述的抗生素为庆大霉素和氨苄青霉素，浓度分别是10μg/ml和100μg/ml。本专利技术的有益效果是：本专利技术成功构建了一种携带标记基因eGFP的家蚕二分浓核病毒的重组表达质粒，所构建的重组质粒在不破坏家蚕二分浓核病毒VD2基因编码的前提下在加入标记基因的完整表达框，既不破坏家蚕二分浓核病毒VD2的编码基因，又增加分析的便捷性，避免了由于病毒基因编码框被破坏带来的实验阻力；本专利技术以eGFP或RGP基因作为标记基因，能够较直观和便捷的判定转染及感染的成功与否，增加实验的便捷性。附图说明图1是重组质粒pFBDM-VD2eGFP的信息标注图谱；图2是抽提出的重组质粒pFBDM-VD2eGFP基因组的双酶切验证图；图中，M1、M2是DNA分子标准，泳道1~5分别表示不同的双酶切后序列；图3重组质粒pFBDM-VD2eGFP基因组转染48小时后Hi5细胞的荧光情况。具体实施方式以下结合实施例对本专利技术作进一步说明，实施例是用于说明本专利技术，而不是用于限制本专利技术的范围。本领域技术人员可以确定本专利技术的基本特征，并且在不偏离本专利技术精神和范围的情况下，可以对本专利技术做出各种修改和改变，以使其使用各种用途和条件。下述实施例中所使用的实验原料如无特殊说明，均可通过商业途径得到。除特殊注明外，本专利技术所采用的均为该领域现有技术。本专利技术中对标记基因没有具体的限定，为了便于不同科研人员实验观察需求可以使用其他标记基因替换本实施例中的eGFP基因，如红色荧光蛋白RGP基因。实施例1：重组质粒pFBDM-VD2eGFP的制备（1）模板质粒pUC-VD2/PmaCI的构建：测定BmBDV的VD2全长序列（GenBank登录号：DQ017269）VD2全长为6022bp，在VD2共有末端序列5`GTGTGTGT前插入CAC三个核苷酸，在3`CACACACA前插入GTG三个核苷酸，将插入后的序列装配在pUC119质粒（购自本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于家蚕二分浓核病毒的重组质粒，其特征在于，包含有VD2完整基因组，含有杆状病毒ie1启动子和sv40终止子完整表达框的标记基因片段。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于家蚕二分浓核病毒的重组质粒，其特征在于，包含有VD2完整基因组，含有杆状病毒ie1启动子和sv40终止子完整表达框的标记基因片段。


2.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述的标记基因为eGFP基因。


3.权利要求1所述的重组质粒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）构建包含VD2完整基因组的pUC-VD2/PmaCI质粒；
（2）以步骤（1）中构建的pUC-VD2/PmaCI质粒为模板，设计引物序列F1和R1，F2和R2；以BmNPV和pFBDM质粒为模板构建得到pT-ie1-eGFP-sv40质粒，根据构建的pT-ie1-eGFP-sv40质粒设计引物序列F3和R3；
（3）利用步骤（2）中设计的引物序列分别进行PCR扩增，以pUC-VD2/PmaCI为模板PCR扩增分别得到上游产物片段VD2-U和下游产物片段VD2-D；以pT-ie1-eGFP-sv40质粒为模板PCR扩增产物片段L-eGFP；
（4）分别将步骤（3）中得到的产物片段酶切胶回收纯化目的片段，依次将酶切后的目的片段VD2-U，L-eGFP，VD2-D与pFBDM质粒载体连接得到重组质粒pFBDM-VD2eGFP。


4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤（1）中所述的pUC-VD2/PmaCI质粒是在BmBDV的VD2基因末端序列5'GTGTGTGT前插入CAC三个核苷酸，在3'CACACACA前插入GTG三个核苷酸，将插入后的序列装配...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡朝阳，孙伟娟，姚勤，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32