【技术实现步骤摘要】
一种金纳米棒功能化整体柱固定化酶反应器的制备方法
本专利技术涉及一种金纳米棒功能化整体柱固定化酶反应器的制备方法，具体是金纳米棒功能化以高内相乳液聚合合成的整体柱，通过金-硫键结合将酶固载到整体柱孔表面，本专利技术旨在提供一种新的固酶基质，实现蛋白质的高效快速酶解。
技术介绍
蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象，研究细胞、组织或生物体所表达的全部蛋白质组成及其变化规律的科学。目前，蛋白组学研究的常用策略包括自上而下和自下而上。由于蛋白质鉴定的准确性，可靠性和可重复性，基于质谱的蛋白质组分析研究的自下而上的策略引起了高度关注。在这种策略中，首先通过蛋白酶将蛋白质样品消化成肽，然后进行液质联用分析以鉴定蛋白质。因此，如何实现蛋白的快速有效酶解成为最具挑战性的步骤之一。过往，蛋白质的消化通常在溶液中进行，但是其具有明显的缺陷，如酶的自溶，酶解效率低，酶解后还需分离酶和底物。为了解决这些问题，已经开发出固定化酶反应器(IMER)，将蛋白酶分子固定于特定的载体上而发挥酶的生物催化作用。与传统的溶液酶解相比，固定化酶反应器不仅可防止酶自身...
【技术保护点】
1.一种金纳米棒功能化整体柱固定化酶反应器的制备方法，其特征在于包括以下步骤：/n1）高内相乳液整体柱的制备：以span 80为表面活性剂，以单体甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）、交联剂二乙烯基苯（DVB）、致孔剂甲苯为油相，以包含引发剂过硫酸钾、电解质氯化钙的水溶液为水相，在不断搅拌下将水相逐滴滴加到油相中，滴/2 s；滴加完成后高速搅拌30-40 min，形成均一的白色油包水型高内相乳液；用注射器将得到的乳液注入到经γ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷(γ-MPS)修饰过的10 cm毛细管柱中，用橡胶塞封住毛细管两端，50-60℃水浴中反应2-3 h；聚合完成后，分别用乙腈、...
【技术特征摘要】
1.一种金纳米棒功能化整体柱固定化酶反应器的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）高内相乳液整体柱的制备：以span80为表面活性剂，以单体甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）、交联剂二乙烯基苯（DVB）、致孔剂甲苯为油相，以包含引发剂过硫酸钾、电解质氯化钙的水溶液为水相，在不断搅拌下将水相逐滴滴加到油相中，滴/2s；滴加完成后高速搅拌30-40min，形成均一的白色油包水型高内相乳液；用注射器将得到的乳液注入到经γ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷(γ-MPS)修饰过的10cm毛细管柱中，用橡胶塞封住毛细管两端，50-60℃水浴中反应2-3h；聚合完成后，分别用乙腈、去离子水冲洗毛细管柱来去除未反应的物质；
2)金纳米棒的功能化：将氨水注入步骤1）中的整体柱，置于50-60℃水浴中反应1-2h，反应完全后用去离子水冲洗毛细管柱直至流出液呈中性，得到氨基修饰的高内相乳液整体柱；之后，室温下向氨基修饰的高内相乳液整体柱通入金纳米棒溶液，通过Au-NH2相互作用将金纳米棒固定于整体柱孔表面，然后用去离子水冲洗直至流出液无淡紫色，得到金纳米棒功能化的高内相乳液整体柱；
3）胰蛋白酶二硫键的还原：用20mMpH8.0的三（羟甲基）氨基甲烷（Tris-HCl）缓冲液溶解胰蛋白酶和三（2-羰基乙基）磷盐酸盐（TCEP），使其浓度分别为10mg/ml，1mg/ml；然后将胰蛋白酶和TCEP以10：1的体积比进行混合，于25℃反应3h；之后，将反应液在4℃下以10000rpm离心10min除去不溶物，取上清液，加入过硫酸铵和N,N’-亚甲基双丙烯酰胺，使其浓度分别为1mg/ml，2mg/ml，震荡使其充分溶解即得酶衍生液；
4）胰蛋白酶的固定：将步骤3）得到的酶衍生液于4℃下泵送3h，通过步骤2）得到的整体柱，通过金纳米棒与胰蛋白酶...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄艳萍，焦雅洁，卫泽辉，刘照胜，
申请(专利权)人：天津医科大学，
类型：发明
国别省市：天津;12
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