猪用二联灭活疫苗及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了猪用二联灭活疫苗及其制备方法和应用。本发明专利技术公开一种猪用二联灭活疫苗，包括：表达O型FMDV VP1基因的重组杆状病毒、猪塞内卡病毒和免疫佐剂。本发明专利技术进一步公开了一种制备所述猪用二联灭活疫苗的方法，包括：(1)将表达O型FMDV VP1基因的重组杆状病毒进行扩增后灭活；将猪塞内卡病毒进行扩增后灭活；(2)将灭活的表达O型FMDV VP1基因的重组杆状病毒液和灭活的猪塞内卡病毒液混合均匀得到水相；(3)将免疫佐剂加热得到油相；(4)将油相加入到水相中混合，乳化，即得。免疫保护效力检测结果证明本发明专利技术制备的猪用二联灭活疫苗能够同时有效防治O型口蹄疫病毒和猪塞内卡病毒。

Bivalent inactivated vaccine for swine and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
猪用二联灭活疫苗及其制备方法和应用
本专利技术涉及猪用二联灭活疫苗，尤其涉及猪口蹄疫杆状病毒载体、猪塞内卡病毒二联灭活疫苗及其制备方法，属于猪用二联灭活疫苗及其应用领域。
技术介绍
O型口蹄疫病毒是口蹄疫病毒属、小RNA病毒科的成员之一。在所有七种口蹄疫病毒血清型中，O型在全世界范围内流行和分布最广，非洲北部、东欧、整个南美洲以及亚洲的大部分地区都有报道，严重威胁全球畜牧业旳发展。灭活苗在制备过程中因设备安全性要求高、工艺复杂、花费大、毒株灭活不完全、有散毒的危险等缺点，因此杆状病毒载体疫苗被认为是口蹄疫病毒疫苗研究领域最具潜力的候选疫苗，利用基因重组技术合成并表达具有病毒抗原表位的病毒样颗粒能够诱导动物产生近乎病毒自然感染的免疫力，一直受到高度重视。塞内卡谷病毒最早由研究者从人胚胎视网膜细胞PER.C6的细胞培养污染物中分离得到，且其被认为源自培养细胞使用的牛血清或者猪源胰蛋白酶。2015年，巴西学者从患有水泡性疾病猪只的水泡液和血清中检测到SVA全基因组的存在，并认为SVV感染与猪的特发性水泡病相关。随后美国、巴西、加拿大、中国、泰国等全球多个国家陆续报道了猪感染SVV的案例。SVV可造成不同年龄阶段的猪群感染，主要临床表现为蹄部和口鼻部发生水泡、溃疡，感染新生仔猪可引起死亡。塞内卡病毒目前尚无商品化的疫苗生产。迄今为止，亟待需要研制一种能够同时有效防治O型口蹄疫病毒和塞内卡病毒的猪用二联灭活疫苗。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种能够同时有效防治O型口蹄疫病毒和塞内卡病毒的猪用二联灭活疫苗；本专利技术的目的之二是提供一种制备所述猪用二联灭活疫苗的方法；本专利技术的上述目的是通过以下技术方案来实现的：一种猪用二联灭活疫苗，包括：表达O型FMDVVP1基因的重组杆状病毒、猪塞内卡病毒和免疫佐剂。所述表达O型FMDVVP1基因的重组杆状病毒的构建方法包括：。(1)将O型FMDVVP1基因克隆至pFastBacⅠ载体得到重组质粒pFB-FMDV-vp1；(2)用重组质粒pFB-FMDV-vp1构建得到重组穿梭杆状质粒rBacmid-FMDV-vp1；(3)将重组穿梭杆状质粒转染昆虫细胞，得到表达O型FMDVVP1基因的重组杆状病毒。为了提高将O型FMDVVP1基因的表达效率，可以将O型FMDVVP1基因进行密码子优化以提高其在昆虫宿主细胞中的表达效率；其中，O型FMDVVP1基因的原始序列是SEQIDNO.1所示，密码子优化后的核苷酸序列为SEQIDNO.2所示；密码子优化后的序列在昆虫细胞中的表达效率相比原始序列有非常显著的提升。其中，所述的昆虫细胞优选为Sf9细胞。本专利技术中所述的猪塞内卡病毒优选为微生物保藏编号为：CGMCCNo.18851的猪塞内卡病毒。本专利技术进一步提供了一种制备所述猪用二联灭活疫苗的方法，包括：(1)将表达O型FMDVVP1基因的重组杆状病毒进行扩增后灭活；将猪塞内卡病毒进行扩增后灭活；(2)将灭活的表达O型FMDVVP1基因的重组杆状病毒液和灭活的猪塞内卡病毒液混合均匀得到水相；(3)将免疫佐剂加热得到油相；(4)将油相加入到水相中混合，乳化，即得。为了取得更好的效果，步骤(2)中将灭活的FMDV-vp1重组杆状病毒液和猪塞内卡病毒液混合后使每头份疫苗中FMDV-vp1蛋白含量不小于40μg、猪塞内卡病毒不小于108.0TCID50。本专利技术中所述的免疫佐剂优选为法国赛比克公司MontanideTM206佐剂；其中，步骤(3)中优选将免疫佐剂加热至30℃得到油相。步骤(4)中控制油相和水相的体积比为1:1；其中，先将水相加入乳化罐内慢速搅拌然后缓慢加入油相佐剂，加完后以800r/min搅拌30分钟，再静止30分钟。灭活疫苗的免疫保护效力检验表明，采用本专利技术制备的猪用二联灭活疫苗免疫猪，猪免疫后每周采血，利用口蹄疫O型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒测定猪血清中FMDV抗体水平以及采用中和试验方法测定血清中SVA中和抗体水平，根据检测结果可见，所有免疫猪的血清中均产生高水平的抗FMDV抗体和抗SVA抗体，免疫保护效力检测结果证明本专利技术制备的猪用二联灭活疫苗能够同时有效防治O型口蹄疫病毒和猪塞内卡病毒。附图说明图1重组杆状病毒穿梭载体DNA的PCR鉴定；1：DNA分子标记DL2000；2：构建好重组杆状病毒穿梭载体；3：阴性对照。具体实施方式以下结合具体实施例来进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本专利技术的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对本专利技术的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本专利技术的保护范围内。实施例1猪用二联灭活疫苗的制备1毒种猪塞内卡病毒，其微生物保藏编号为：CGMCCNo.18851；分类命名：塞内卡病毒；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2019年10月29日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。2试验方法2.1猪口蹄疫杆状病毒制备2.1.1FMDV-vp1基因的设计与合成将O型FMDVVP1基因(SEQIDNO.1)经密码子优化后得到优化后的序列(SEQIDNO.2)，在优化后的序列两端添加EcoRⅠ和HindIII酶切位点克隆至pFastBacⅠ载体，形成重pFB-FMDV-vp1。2.1.2重组穿梭杆状质粒rBacmid-FMDV-vp1的构建与制备2.1.2.1重组穿梭杆状质粒的构建将1μL重组质粒pFB-FMDV-vp1加入至200μL于冰上融化的DH10Bac感受态细胞，轻轻混匀后冰浴30min，42℃热激45s，迅速置于冰上2min，加入900μL的S.O.C培养基，37℃220rpm振荡培养4h，然后用S.O.C培养基做10-1，10-2，10-3三个稀释度，每个稀释度取150μL均匀的涂布于LB选择性琼脂平板上，37℃温箱避光培养36-48h，直至清晰蓝白菌落出现。2.1.2.2重组杆状病毒穿梭载体DNA的提取将LB选择性平板放于4℃冰箱2h，使菌落充分显色，将平板取出进行蓝白斑的筛选，挑取平板上较大的散在白色单菌落，重新划线接种于LB选择性平板进行第二次的蓝白斑筛选，37℃过夜培养后，同样，挑取平板上较大的散在白色单菌落接种至含50μg/ml的卡那霉素，7μg/ml的庆大霉素，10μg/ml的四环霉素的LB液体培养基中37℃220rpm振荡培养16个小时，提取杆粒DNA。2.1.2.3重组杆状病毒穿梭载体DNA的PCR鉴定以提取的重组杆状病毒穿梭载体DNA为模板，利用表1的FMDV-vp1-R/FMDV-vp1-F引物进行PCR扩增。表1FMDV-vp1-R/FMDV-vp1-F引物序列循环参数：94℃预变性5min；9本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪用二联灭活疫苗，其特征在于，包括：表达O型FMDV VP1基因的重组杆状病毒、猪塞内卡病毒和免疫佐剂。/n

【技术特征摘要】
1.一种猪用二联灭活疫苗，其特征在于，包括：表达O型FMDVVP1基因的重组杆状病毒、猪塞内卡病毒和免疫佐剂。


2.按照权利要求1所述的猪用二联灭活疫苗，其特征在于，所述表达O型FMDVVP1基因的重组杆状病毒的构建方法包括：
(1)将O型FMDVVP1基因克隆至pFastBacⅠ载体得到重组质粒pFB-FMDV-vp1；(2)用重组质粒pFB-FMDV-vp1构建得到重组穿梭杆状质粒rBacmid-FMDV-vp1；(3)将重组穿梭杆状质粒转染昆虫细胞，得到表达O型FMDVVP1基因的重组杆状病毒。


3.按照权利要求2所述的猪用二联灭活疫苗，其特征在于，所述的O型FMDVVP1基因是密码子优化后的基因，其核苷酸序列为SEQIDNO.2所示；所述的昆虫细胞为Sf9细胞。


4.按照权利要求1所述的猪用二联灭活疫苗，其特征在于，所述猪塞内卡病毒的微生物保藏编号为：CGMCCNo.18851。


5.一种制备权利要求1所述猪用二联灭活疫苗的方法，包括：
(1)将表达O型FMDVVP1...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋扬，柴华，杨淑萍，刘鑫莹，李应鹤，武啸，李贽，郭照成，马萌萌，孟福强，
申请(专利权)人：哈药集团生物疫苗有限公司，
类型：发明
国别省市：黑龙;23