HOXA7和HOXA9甲基化检测试剂在制备肺癌诊断试剂中的用途制造技术

本发明专利技术属于基因诊断领域，涉及一种以痰液为检测样本，且以HOXA7和HOXA9的甲基化为检测对象的检测试剂在制备肺癌诊断试剂中的应用。本发明专利技术首次在痰液中，共同以HOXA7和HOXA9作为检测肺癌的肿瘤标志物，其在痰液中的敏感度高达97.1％，特异性高达90.9％，检测敏感度高于现有报道的肺癌肿瘤标志物，尤其是对腺癌，其敏感度甚至达到了100％，对于腺癌的检测和诊断有极大的应用价值。

The use of HOXA7 and HOXA9 methylation detection reagents in the preparation of lung cancer diagnostic reagents

【技术实现步骤摘要】
HOXA7和HOXA9甲基化检测试剂在制备肺癌诊断试剂中的用途
本专利技术属于基因诊断领域，更具体地，本专利技术涉及一种人HOXA7和人HOXA9基因甲基化检测试剂在制备肺癌诊断试剂中的应用，以及人HOXA7基因和HOXA9基因甲基化检测的方法。技术背景肺癌是起源于支气管粘膜、腺体或肺泡上皮的肺部恶性肿瘤。按照病理类型可以分为：1.小细胞肺癌(smallcelllungcancer，SCLC)：一种特殊病理学类型的肺癌，有明显的远处转移倾向，预后较差，但多数病人对放化疗敏感。2.非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer，NSCLC)：除小细胞肺癌以外其他病理学类型的肺癌，包括鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌等。在生物学行为和临床病程方面具有一定差异。按照发生位置又可以分为：1.中心型肺癌(centrallungcancer)：生长在肺段支气管开口及以上的肺癌。2.周围型肺癌(peripherallungcancer)：生长在肺段支气管开口以远的肺癌。近年来，人口老龄化、大气污染及吸烟等因素的影响，致使中国肺癌的发病率和死亡率逐年递增，根据国家癌症中心发布的《2017中国肿瘤登记年报》显示，全国每分钟约7人确诊患癌，其中肺癌发病率与死亡率均为第一位。中国已成为世界上肺癌人数最多的国家，专家预测到2025年中国肺癌的人数将达到100万。而根据流行病学研究显示：吸烟是引起肺癌的重要因素。世界上约80％-90％的肺癌可归因于吸烟。与非吸烟者相比，45-64岁每日吸香烟1-19支和20支以上者患肺癌的相对危险度分别为4.27和8.61，与从不吸烟者比较，长期每日吸烟1-19支和20支以上者死于肺癌的相对危险度分别为6.14和10.73。虽然肺癌的治疗技术日新月异，但5年生存率从4％仅上升至12％左右，现有的抗肿瘤药物仍只能起到缓解病情作用，患者无进展生存期平均仅延长3个月～5个月，但对于Ⅰ期肺癌患者，手术后5年生存率高达约60％～70％。因此肺癌的早期诊断与早期手术是提高肺癌5年生存率、降低死亡率最有效的方法之一。肺癌目前的临床辅助诊断主要有以下几种，但是他们都不能完全做到早发现，早诊断：1.血液生化检查：对于原发性肺癌，目前无特异性血液生化检查。肺癌病人血液碱性磷酸酶或血钙升高考虑骨转移的可能，血液碱性磷酸酶、谷草转氨酶、乳酸脱氢酶或胆红素升高考虑肝转移的可能。2.肿瘤标志物检查：(1)CEA：30％～70％肺癌患者血清中有异常高水平的CEA，但主要见于较晚期肺癌患者。目前血清中CEA的检查主要用于估计肺癌预后以及对治疗过程的监控。(2)NSE：是小细胞肺癌首选标志物，用于小细胞肺癌的诊断和监测治疗反应，根据检测方法和使用试剂的不同，参考值不同。3)CYFRA21-1：是非小细胞肺癌的首选标记物，对肺鳞癌诊断的敏感性可达60％，根据检测方法和使用试剂的不同，参考值不同。3.影像学检查：(1)胸部X线检查：应包括胸部正位和侧位片。在基层医院，胸部正侧位片仍是肺癌初诊时最基本和首选的影像诊断方法。一旦诊断或疑诊肺癌，即行胸部CT检查。(2)CT检查：胸部CT是肺癌的最常用和最重要的检查方法，用于肺癌的诊断与鉴别诊断、分期及治疗后随诊。有条件的医院在肺癌病人行胸部CT扫描时范围应包括肾上腺。应尽量采用增强扫描，尤其是肺中心型病变的患者。CT是显示脑转移瘤的基本检查方法，有临床症状者或进展期病人应行脑CT扫描，并尽可能采用增强扫描。CT引导下肺穿刺活检是肺癌的重要诊断技术，有条件的医院可将其用于难以定性的肺内病变的诊断，以及临床诊断肺癌需经细胞学、组织学证实而其它方法又难以取材的病例。(3)超声检查：主要用于发现腹部重要器官及腹腔、腹膜后淋巴结有无转移，也用于颈部淋巴结的检查。对于贴邻胸壁的肺内病变或胸壁病变，可鉴别其囊实性及进行超声引导下穿刺活检；超声还常用于胸水抽取定位。(4)骨扫描：对肺癌骨转移检出的敏感性较高，但有一定的假阳性率。可用于以下情况：肺癌的术前检查；伴有局部症状的病人。4.其它检查：(1)痰细胞学检查：目前肺癌简单方便的无创诊断方法，连续涂片检查可提高阳性率约达60％，是可疑肺癌病例的常规诊断方法。(2)纤维支气管镜检查：肺癌诊断中最重要的手段之一，对于肺癌的定性定位诊断和手术方案的选择有重要的作用。对拟行手术治疗的患者为必需的常规检查项目。而经支气管镜穿刺活检检查(TBNA)，虽利于治疗前分期，但因技术难度和风险较大，有需要者应转上级医院进一步检查。(3)其他：如经皮肺穿刺活检、胸腔镜活检、纵隔镜活检、胸水细胞学检查等，在有适应证的情况下，可根据现有条件分别采用以协助诊断。影像学检查中的多层螺旋CT和低剂量CT(LDCT)是发现早期肺癌和降低死亡率的有效筛查工具，全美国家肺癌筛查研究(NLST)已经表明LDCT相比胸部X线筛查可降低20％肺癌的死亡率。在临床实践工作中证明，任何肺癌筛查项目的成败取决于高危人群的识别，融合多重高危因素的风险预测模型已被世界公认是识别肺癌高危人群的方法之一。风险模型通过协助临床医生改进干预措施或治疗手段，从而进一步改善肺癌患者的疗效。虽然世界已经认同针对高危人群的筛查能够降低肺癌目前较高的死亡率，但高危人群界定仍然是难以解决的问题。为了使肺癌筛查的效益-伤害比达到最大化，关键的问题第一是如何界定高危患病风险的人群；第二是用什么方法对该人群进行筛查，包括高危因素的界定，总体风险的量化汇总以及筛查效益界值的选择。随着技术的飞速发展，肿瘤标志物检测成为继影像学诊断，病理诊断之后的肿瘤诊断治疗新领域，能够对肿瘤的诊断，检测，治疗产生重大的影响。肿瘤标志物可以在体液或者是组织中检测到，能够反映肿瘤的存在，分化程度，预后估计和个性化用药以及治疗效果等。早期肺癌患者没有明显的症状，难以被医生和患者察觉，再加之其在血液或生化项目上没有明显的特异性的标识物，因此难以通过常规的诊断方法进行早期发现和早期诊断，因此对肺癌早期诊断，尤其是大规模应用人群筛查上较为困难。越来越多的研究表明，在肿瘤形成过程中包含两大类机制。一个是通过DNA核苷酸序列改变而形成突变，即遗传学机制。肿瘤作为一种遗传学疾病在分子生物学领域已经得到证实。另外一个就是表观遗传学(epigenetics)机制，即不依赖DNA序列改变导致基因表达水平的变化，它在肿瘤形成过程中的作用越来越受到重视。遗传学与表观遗传学两种机制相互交叉存在，共同促进了肿瘤的形成。基因的异常甲基化在肿瘤发生的早期就可出现，并且在肿瘤逐步发展的过程中，基因异常甲基化的程度增加。对常见的98种人类原发肿瘤的基因组进行分析，发现每种肿瘤至少有600个异常甲基化的CpG岛。许多研究显示启动子异常甲基化在许多肿瘤的发生过程中是一个频发的早期事件，因此肿瘤相关基因的甲基化状态是肿瘤发生的一个早期敏感指标，被认为是一种有前景的肿瘤分子生物标志物(biomarker)。更为重要的是，癌变细胞可以释放DNA到外周血中。正常人外周血中都存在纳克级的游离DNA。研究发现外周血血浆/血清、肿瘤累及器官相关的体液(如唾液、痰等)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.HOXA7基因或其核酸片段，以及HOXA9基因或其核酸片段在制备肺癌诊断试剂或试剂盒中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.HOXA7基因或其核酸片段，以及HOXA9基因或其核酸片段在制备肺癌诊断试剂或试剂盒中的应用。


2.HOXA7基因和HOXA9基因甲基化的检测试剂在制备肺癌诊断试剂中的应用。


3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的HOXA7和HOXA9基因甲基化的检测试剂检测HOXA7基因和HOXA9基因经转化试剂修饰后的序列；
优选地，所述的转化试剂选自肼盐、重亚硫酸氢盐和亚硫酸氢盐中的一种或几种；
优选地，所述的转化试剂选自重亚硫酸氢盐。


4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述甲基化的检测试剂的检测区域为HOXA7基因和HOXA9基因的基因体或者其启动子区域；
优选地，所述的试剂针对HOXA7的检测区域包含SEQIDNO：25或SEQIDNO：27所示的序列；所述的试剂针对HOXA9的检测区域包含SEQIDNO：29、SEQIDNO：31或SEQIDNO：33所示的序列；
更优选地，所述的试剂针对HOXA7的检测区域包含SEQIDNO：27所示的序列，所述的试剂针对HOXA9的检测区域包含SEQIDNO：29所示的序列。


5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述甲基化的检测试剂含有检测HOXA7基因和HOXA9基因的引物对；
优选地，检测HOXA7基因的引物对选自SEQIDNO：1-2，SEQIDNO：37-38，SEQIDNO：40-41，SEQIDNO：43-44，或SEQIDNO：46-47，SEQIDNO：49-50，SEQIDNO：52-53，SEQIDNO：55-56，SEQIDNO：58-59或SEQIDNO：61-62所示的引物对；
更优选地，检测HOXA7基因的引物对选自SEQIDNO：1-2所示的引物对；优选地，检测HOXA9基因的引物对选自SEQIDNO：4-5，SEQIDNO：64-65，SEQIDNO：67-68，SEQIDNO：70-71，SEQIDNO：73-74，SEQIDNO：76-77，SEQIDNO：79-80，SEQIDNO：82-83，SEQIDNO：85-86，SEQIDNO：88-89或SEQIDNO：91-92所示的引物对；
更优选地，检测HOXA9基因的引物对选自SEQIDNO：4-5所示的引物对。


6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述甲基化的检测试剂含有检测HOXA7基因和HOXA9基因的探针；
优选地，检测HOXA7基因的探针选自SEQIDNO：3、SEQIDNO：39、SEQIDNO：42、SEQIDNO：45、SEQIDNO：48、SEQIDNO：51、SEQIDNO：54、SEQIDNO：57、SEQIDNO：60或SEQIDNO：63所示的序列；
更优选地，检测HOXA7基因的探针选自SEQIDNO：3所示的序列；
优选地，检测HOXA9基因的探针选自SEQIDNO：6、SEQIDNO：66、SEQIDNO：69、SEQIDNO：72、SEQIDNO：75、SEQIDNO：78、...

【专利技术属性】
技术研发人员：牛智通，李仕良，黄龙武，赵荣淞，吴幽治，赵霞，邹鸿志，
申请(专利权)人：广州市康立明生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：广东;44