固定化酶、其制备方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种固定化酶、其制备方法及其应用。该固定化酶包括酶及固定酶的氨基树脂载体，酶选自转氨酶、酮还原酶、单加氧酶、氨裂解酶、烯还原酶、亚胺还原酶、氨基酸脱氢酶及腈水解酶中的任意一种，氨基树脂载体为交联剂修饰的氨基树脂载体，交联剂为经过高聚物处理过的交联剂。通过采用高聚物处理过的交联剂对氨基树脂载体进行修饰，有利于使固定于其上的酶形成网状交联，进而使这些酶的固定效果更加稳定，从而提高这些酶的循环利用效率。

Immobilized enzyme, its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
固定化酶、其制备方法及其应用
本专利技术涉及固定化酶领域，具体而言，涉及一种固定化酶、其制备方法及其应用。
技术介绍
微生物细胞或分离的酶或工程酶的应用使得生物催化取得了重大进展，且使得制造方式发生了转变。许多种类的酶如酰基转移酶、酰胺酶、转氨酶、酮还原酶、氧化酶、单加氧酶及水解酶等被用于生产涉及抗生素、除草剂、医药中间体和新时代治疗剂的反应中。当游离酶用作生物催化剂时，会有很大的酶浪费，因为回收水溶性酶非常困难。而水不溶性固定化酶，在每个循环后，通过非常简单的过滤就可以容易地回收。现有技术中已经有报道单一酶的固定化方法，但不同的酶所适合的固定化方法是不同的。比如Bolivar等(Biomacromol.2006,7,669-673)研究了来自假单胞菌SP101的FDH的共价固定化，包括共价固定于改性琼脂糖、CNBr活化的琼脂糖、Sepabeads(葡聚糖)及乙醛琼脂糖的各种载体上。其得出的结论是：固定化于溴化物，聚乙烯亚胺，戊二醛等活化的载体上并不会促进酶在热灭活下的任何稳定作用。然而，高度活化的乙二醛琼脂糖的优化的酶被证明是具有很高的热稳定性、pH稳定性并且在具有增强的稳定性情况下具有超过50％的活性。Kimetal(J.Mol.CatalB:Enzy97(2013)209–214)报道了使用交联酶聚集体(CLEA)的方法来固定来自Candidaboidinii.的甲酸脱氢酶(formatedehydrogenase，FDH)，并认为葡聚糖多醛(dextranpolyaldehyde)作为交联剂代替戊二醛(glutaraldehyde)对于固定化酶更好，经过10次重复使用后残留活性超过95％。此外，葡聚糖多醛形成的交联酶聚集体(Dex-CLEA)的热稳定性比游离酶的热稳定性提高了3.6倍。Binayetal(BeilsteinJ.Org.Chem.2016,12,271–277)报道了高活性的来源于Candidamethylica的FDH的固定化酶，FDH共价固定到环氧活化Immobead150载体上。Immobead150载体先经过乙二胺(ethylenediamin)修饰，然后依次经过戊二醛活化(FDHIGLU)及醛基官能化(FDHIALD)。当使用醛基官能化的Immobead150作为载体时，分别获得最高的固定化产率和活性产率，分别为90％和132％。在35℃下，游离FDH、FDHI150、FDHIGLU和FDHIALD的半衰期(t1/2)分别计算为10.6、28.9、22.4和38.5小时。FDHI150、FDHIGLU和FDHIALD在10次重复使用后分别保留了其初始活动的69％，38％和51％。Jackon等(ProcessBiochem.Vol.1,9,Sep2016,1248-1255)报道了采用乙二醛-琼脂糖对LDH的固定化。与其可溶性对应物相比，固定化LDH获得的热稳定因子大1600倍。综上可知，现有技术中仍存在大量的酶尚无有效的固定化酶形式，对这些酶的固定化以提高酶的可循环利用性便成了亟待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于提供一种固定化酶、其制备方法及其应用，以解决现有技术此类酶难以循环利用的问题。为了实现上述目的，根据本专利技术的一个方面，提供了一种固定化酶，该固定化酶包括酶及固定酶的氨基树脂载体，酶选自转氨酶、酮还原酶、单加氧酶、氨裂解酶、烯还原酶、亚胺还原酶、氨基酸脱氢酶及腈水解酶中的任意一种，氨基树脂载体为交联剂修饰的氨基树脂载体，交联剂为经过高聚物处理过的交联剂。进一步地，转氨酶为来源于ChromobacteriumviolaceumDSM30191的转氨酶或来源于Aspergillusfumigatus的转氨酶或者来源于Arthrobactercitreus的转氨酶，优选地，来源于ChromobacteriumviolaceumDSM30191的转氨酶为具有SEQIDNO：2或SEQIDNO：3所示序列的突变体；来源于Arthrobactercitreus的转氨酶为具有SEQIDNO：5或SEQIDNO：6所示序列的突变体；优选地，酮还原酶为来源于Acetobactersp.CCTCCM209061或者CandidamacedoniensisAKU4588的酮还原酶，更优选来源于Acetobactersp.CCTCCM209061的酮还原酶为具有SEQIDNO：8或SEQIDNO：9所示序列的突变体；优选地，单加氧酶为来源于Rhodococcussp.Phi1的环己酮单加氧酶，或者来源于Brachymonaspetroleovorans的环己酮单加氧酶，或来源于Rhodococcusruber-SD1的单加氧酶，更优选地，来源于Rhodococcussp.Phi1的环己酮单加氧酶为具有SEQIDNO：11或SEQIDNO：12所示序列的突变体；来源于Rhodococcusruber-SD1的环己酮单加氧酶为具有SEQIDNO：14或SEQIDNO：15所示序列的突变体；优选地，氨裂解酶为来源于photorhabdusluminescens或Solenostemonscutellarioides的氨裂解酶；优选地，烯还原酶为来源于Saccharomycescerevisiae或Chryseobacteriumsp.CA49的烯还原酶；优选地，亚胺还原酶为来源于Streptomycessp或Bacilluscereus的亚胺还原酶；优选地，氨基酸脱氢酶为来源于Bacilluscereus的亮氨酸脱氢酶或者来源于Bacillussphaericus的苯丙氨酸脱氢酶；优选地，腈水解酶为来源于AspergillusnigerCBS513.88或NeurosporacrassaOR74A的腈水解酶。进一步地，氨基树脂载体为带有C2或C4连接臂的氨基树脂载体，优选地，氨基树脂载体选自如下任意一种：LX1000EA、LX1000HA、LX1000NH、LX1000EPN、HM100D、ECR8309、ECR8409、ECR8305、ECR8404、ECR8315、ECR8415、ESR-1、ESR-3、ESR-5及ESR-8。进一步地，交联剂为戊二醛，高聚物为PEG或PEI；优选地，PEG选自PEG400～PEG6000中的任一种；优选地，PEI选自分子量为3～70KDa的PEI；更优选地，PEG与戊二醛的质量比为1:1～10:1，进一步优选为2：1～5:1；更优选地，PEI与戊二醛的质量比为3：1～1：5，进一步优选为1：1～1：2。在本申请的第二个方面提，供了一种固定化酶的制备方法，该制备方法包括：采用高聚物对交联剂进行前处理，得到处理交联剂；利用处理交联剂对氨基树脂载体进行修饰，得到修饰载体；将酶固定于修饰载体上，得到固定化酶；其中，酶选自转氨酶、酮还原酶、单加氧酶、氨裂解酶、烯还原酶、亚胺还原酶、氨基酸脱氢酶及腈水解酶中的任意一种。进一步地，转氨酶为来源于Chromo本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种固定化酶，所述固定化酶包括酶及固定所述酶的氨基树脂载体，其特征在于，/n所述酶选自转氨酶、酮还原酶、单加氧酶、氨裂解酶、烯还原酶、亚胺还原酶、氨基酸脱氢酶及腈水解酶中的任意一种；/n所述氨基树脂载体为交联剂修饰的氨基树脂载体，其中所述交联剂为经过高聚物处理过的交联剂。/n

【技术特征摘要】
1.一种固定化酶，所述固定化酶包括酶及固定所述酶的氨基树脂载体，其特征在于，
所述酶选自转氨酶、酮还原酶、单加氧酶、氨裂解酶、烯还原酶、亚胺还原酶、氨基酸脱氢酶及腈水解酶中的任意一种；
所述氨基树脂载体为交联剂修饰的氨基树脂载体，其中所述交联剂为经过高聚物处理过的交联剂。


2.根据权利要求1所述的固定化酶，其特征在于，
所述转氨酶为来源于ChromobacteriumviolaceumDSM3019、Aspergillusfumigatus、Arthrobactercitreus的转氨酶，优选地，所述来源于ChromobacteriumviolaceumDSM30191的转氨酶为具有SEQIDNO：2或SEQIDNO：3所示序列的突变体；所述来源于Arthrobactercitreus的转氨酶为具有SEQIDNO：5或SEQIDNO：6所示序列的突变体；
优选地，所述酮还原酶为来源于Acetobactersp.CCTCCM209061或者CandidamacedoniensisAKU4588的酮还原酶，更优选所述来源于Acetobactersp.CCTCCM209061的酮还原酶为具有SEQIDNO：8或SEQIDNO：9所示序列的突变体；
优选地，所述单加氧酶为来源于Rhodococcussp.Phi1的环己酮单加氧酶，或者来源于Brachymonaspetroleovorans的环己酮单加氧酶，或来源于Rhodococcusruber-SD1的单加氧酶，更优选地，所述来源于Rhodococcussp.Phi1的环己酮单加氧酶为具有SEQIDNO：11或SEQIDNO：12所示序列的突变体；所述来源于Rhodococcusruber-SD1的环己酮单加氧酶为具有SEQIDNO：14或SEQIDNO：15所示序列的突变体；
优选地，所述氨裂解酶为来源于photorhabdusluminescens或Solenostemonscutellarioides的氨裂解酶；
优选地，所述烯还原酶为来源于Saccharomycescerevisiae或Chryseobacteriumsp.CA49的烯还原酶；
优选地，所述亚胺还原酶为来源于Streptomycessp或Bacilluscereus的亚胺还原酶；
优选地，所述氨基酸脱氢酶为来源于Bacilluscereus的亮氨酸脱氢酶或者来源于Bacillussphaericus的苯丙氨酸脱氢酶；
优选地，所述腈水解酶为来源于AspergillusnigerCBS513.88或NeurosporacrassaOR74A的腈水解酶。


3.根据权利要求1或2所述的固定化酶，其特征在于，所述氨基树脂载体为带有C2或C4连接臂的氨基树脂载体，
优选地，所述氨基树脂载体选自如下任意一种：LX1000EA、LX1000HA、LX1000NH、LX1000EPN、HM100D、ECR8309、ECR8409、ECR8305、ECR8404、ECR8315、ECR8415、ESR-1、ESR-3、ESR-5及ESR-8。


4.根据权利要求1或2所述的固定化酶，其特征在于，所述交联剂为戊二醛，所述高聚物为PEG或PEI；
优选地，所述PEG选自PEG400～PEG6000中的任一种；
优选地，所述PEI选自分子量为3～70KDa的PEI；
更优选地，所述PEG与所述戊二醛的质量比为1:1～10:1，进一步优选为2：1～5:1；
更优选地，所述PEI与所述戊二醛的质量比为3：1～1：5，进一步优选为1：1～1：2。


5.一种固定化酶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
采用高聚物对交联剂进行前处理，得到处理交联剂；
利用所述处理交联剂对氨基树脂载体进行修饰，得到修饰载体；
将酶固定于所述修饰载体上...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪浩，詹姆斯·盖吉，肖毅，张娜，罗杰斯卡·维亚撒·威廉姆斯，崔瑜霞，赵佳东，郝明敏，高妍妍，
申请(专利权)人：吉林凯莱英医药化学有限公司，
类型：发明
国别省市：吉林;22