实时数字PCR方法及其装置制造方法及图纸

本发明专利技术实施方式涉及实时数字PCR方法及装置，实时数字PCR方法包括:将含有待扩增样品的PCR试剂加入到载体芯片中，PCR试剂在所述载体芯片中被分割为相互独立的微液滴；对待扩增样品进行扩增反应，待扩增样品完成预设次数的扩增反应之后，暂停扩增反应，对载体芯片进行拍摄，并识别载体芯片中独立反应单元的光信号，然后再次进行扩增，拍照，信号识别的循环步骤，直到扩增终点；最后生成所有独立反应单元的扩增曲线，通过比对每次获取的各个反应单元图像信号以及扩增曲线的差异，判断并识别出有效反应单元，或判断独立反应单元内靶核酸分子数；通过扩增终点的有效反应单元的光信号，判断阳性扩增反应单元或阴性扩增反应单元个数。

Real time digital PCR method and its device

【技术实现步骤摘要】
实时数字PCR方法及其装置
本专利技术实施方式涉及基因扩增监测领域，特别涉及一种实时数字PCR方法及其装置。
技术介绍
数字PCR，是将含有核酸模板的PCR反应溶液分割成千上万甚至百万、千万个独立反应单元中，最后依据扩增反应后的阳性反应单元个数或阴性反应单元个数，再通过泊松分布统计出靶核酸分子的绝对浓度。由于靶核酸的定量不像传统的实时定量PCR(qPCR)需要借助标准曲线，所以数字PCR定量精度和检测灵敏度更高。然而，本专利技术的专利技术人发现现有技术中至少存在如下问题：由于各种因素(独立反应单元内进入杂质等)的干扰，个别的独立反应单元会有产生假阳性信号或假阴性信号的可能，导致数字PCR定量精度受损。
技术实现思路
本专利技术实施方式的目的在于提供一种实时数字PCR方法及其装置，可以对进样后的载体芯片进行评估，同时还可以排除假阳性或假阴性信号的干扰，解决了由于各种因素(独立反应单元内进入杂质等)的干扰而导致的数字PCR定量精度受损的问题，并且可以实现实时的数字PCR监测，生成所有独立反应单元的扩增曲线。为解决上述技术问题，本专利技术的实施方式提供了一种实时数字PCR方法，具体步骤包括：将含有待扩增样品的PCR试剂加入到载体芯片中，PCR试剂在载体芯片中被分割为相互独立的微液滴，其中，每一个微液滴作为一个独立反应单元；重复执行以下步骤，直至扩增终点：将加入待扩增样品后的载体芯片转移到扩增区进行扩增反应，扩增反应为热循环反应，待扩增样品完成预设次数的扩增反应之后，暂停扩增反应，并将载体芯片转移到成像区，对载体芯片进行拍摄，并识别载体芯片中每一个独立反应单元的光信号；根据每次识别的载体芯片中的每一个独立反应单元的光信号，生成每一个独立反应单元的扩增曲线；通过比对每次拍摄的每一个独立反应单元的光信号，或/和，每一个独立反应单元的扩增曲线的差异，判断并识别独立反应单元中的有效反应单元；通过扩增终点的每一个有效反应单元的光信号，判断阳性扩增反应单元和阴性扩增反应单元个数。本专利技术实施方式相对于现有技术而言，通过控制载体芯片进行预设次数的扩增循环后进行拍摄并识别每一个独立反应单元的光信号，直至扩增终点；排除载体芯片中出现的假阳性或假阴性扩增反应单元，解决了由于各种因素(独立反应单元内进入杂质等)的干扰而导致的数字PCR定量精度受损的问题。另外，载体芯片为具有多于100、1000或10000个微腔室的微流板，和/或使油包水液滴单层排列的微流板；其中，每一个微腔室或油包水液滴都作为一个独立反应单元。另外，待扩增样品加入到载体芯片中后，对加入待扩增样品后的载体芯片进行扩增反应前，还包括：对载体芯片进行拍摄，并识别载体芯片中每一个独立反应单元的光信号。另外，通过扩增终点的每一个有效反应单元的光信号，判断阳性扩增反应单元和阴性扩增反应单元个数之后，还包括：根据扩增曲线生成每一个有效反应单元的阈值循环数；根据阈值循环数判断每一个有效反应单元的模版个数并进行模版定量。本专利技术实施方式还提供一种实时数字PCR装置，包括：扩增模块，载体芯片位于扩增模块内时，载体芯片中携带的待扩增样品进行扩增反应；成像模块，用于拍摄载体芯片；获取模块，基于成像模块的拍摄结果，获取载体芯片中每一个独立反应单元的光信号；判断模块，通过获取模块获取的载体芯片每一个独立反应单元的光信号，判断并识别载体芯片中的假阳性或假阴性扩增反应单元；处理模块，用于根据获取模块获取的载体芯片中每一个独立反应单元的光信号生成每一个独立反应单元的扩增曲线，依据扩增曲线再次判断每一个独立反应单元是否为有效反应单元；并根据每一个有效反应单元的光信号，判断阳性扩增反应单元和阴性扩增反应单元个数。控制模块，用于重复执行下述步骤，直至扩增终点：载体芯片位于扩增模块内完成预设次数的扩增循环之后，扩增暂停；控制模块控制载体芯片转移到成像模块，成像模块对载体芯片进行拍摄；成像模块对载体芯片完成拍摄之后，控制模块控制载体芯片转移到扩增模块继续进行扩增。另外，实时数字PCR装置还包括：进样模块，进样模块用于将待扩增样品加入载体芯片中；载体芯片在进样模块完成待扩增样品的加入后，控制模块控制载体芯片转移到扩增模块进行扩增。将进样模块接入实时数字PCR装置中，待扩增样品通过进样模块加入载体芯片，实现了实时数字PCR装置的待扩增样品的进样自动化。另外，实时数字PCR装置还包括：承载模块，承载模块用于承载不少于一个的载体芯片。另外，载体芯片在进样模块完成待扩增样品的加入后，控制模块控制载体芯片转移到扩增模块进行扩增之前，还包括：控制模块控制载体芯片转移到成像模块进行拍摄，成像模块对载体芯片完成拍摄之后，控制模块控制载体芯片转移到扩增模块进行扩增。另外，成像模块顶部还具有用于遮光的第一盖板，当成像模块用于对载体芯片进行拍摄时，载体芯片位于第一盖板与成像模块之间。通过第一盖板进行遮光，防止外界光源对成像模块进行拍摄时的不良影响。另外，扩增模块顶部还具有用于隔热的第二盖板。通过第二盖板进行隔热，防止扩增模块中的热量外溢或外界热量对扩增模块造成影响。另外，成像模块至少包括以下光通道中的其中两种：可见光通道、FAM通道、CY5通道、ROX通道、HEX通道、AF700通道。另外，实时数字PCR装置还包括：分析模块，用于根据处理模块生成的扩增曲线，通过扩增曲线生成每一个有效反应单元的阈值循环数；并根据Ct值确定每一个有效反应单元的模版个数进行模版定量。通过对扩增曲线的阈值循环数进行判断，依据泊松分布统计靶核酸分子数，并用依据扩增曲线分析所得的结果做进一步验证。相对于现有技术而言，本专利技术实施方式提供一种实时数字PCR方法及其装置，解决了由于各种因素(独立反应单元内进入杂质等)的干扰而导致的定量精度受损的问题，并实现实时的数字PCR监测，生成所有反应单元的扩增曲线。附图说明一个或多个实施方式通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施方式的限定，附图中具有相同参考数字标号的元件表示为类似的元件，除非有特别申明，附图中的图不构成比例限制。图1是本专利技术第一实施方式所涉及的实时数字PCR方法的流程图；图2是本专利技术第二实施方式所涉及的实时数字PCR方法的流程图；图3是本专利技术第三实施方式所涉及的实时数字PCR装置的虚拟模块示意图；图4-图6是本专利技术第三实施方式所涉及的实时数字PCR装置的结构示意图；图7是本专利技术第四实施方式所涉及的实时数字PCR装置的结构示意图；图8-图9是本专利技术第五实施方式所涉及的实时数字PCR装置的结构示意图；图10是本专利技术第六实施方式所涉及的实时数字PCR装置的虚拟模块示意图。具体实施方式目前，由于各种因素(独立反应单元内进入杂质等)的干扰，个别的独立反应单元会有产生假阳性信号或假阴性信号的可能，导致数字PCR定量精度受损。为解决上述问题，本专利技术实施方式提供一种实时数字PCR方法，通过控制载体芯片每进行预设次数的扩增循本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种实时数字PCR方法，其特征在于，具体步骤包括：/na)将含有待扩增样品的PCR试剂加入到载体芯片中，所述PCR试剂在所述载体芯片中被分割为相互独立的微液滴，其中，每一个所述微液滴作为一个独立反应单元；/nb)重复执行以下步骤，直至扩增终点：/n将加入所述待扩增样品后的所述载体芯片转移到扩增区进行扩增反应，所述扩增反应为热循环反应，/n所述待扩增样品完成预设次数的扩增反应之后，暂停所述扩增反应，并将所述载体芯片转移到成像区，/n对所述载体芯片进行拍摄，并识别所述载体芯片中每一个所述独立反应单元的光信号；/nc)根据每次识别的所述载体芯片中的所述每一个独立反应单元的光信号，生成所述每一个独立反应单元的扩增曲线；/nd)通过比对每次拍摄的所述每一个独立反应单元的光信号，或/和，所述每一个独立反应单元的所述扩增曲线的差异，判断并识别所述独立反应单元中的有效反应单元；/ne)通过所述扩增终点的每一个所述有效反应单元的光信号，判断阳性扩增反应单元和阴性扩增反应单元个数。/n

【技术特征摘要】
1.一种实时数字PCR方法，其特征在于，具体步骤包括：
a)将含有待扩增样品的PCR试剂加入到载体芯片中，所述PCR试剂在所述载体芯片中被分割为相互独立的微液滴，其中，每一个所述微液滴作为一个独立反应单元；
b)重复执行以下步骤，直至扩增终点：
将加入所述待扩增样品后的所述载体芯片转移到扩增区进行扩增反应，所述扩增反应为热循环反应，
所述待扩增样品完成预设次数的扩增反应之后，暂停所述扩增反应，并将所述载体芯片转移到成像区，
对所述载体芯片进行拍摄，并识别所述载体芯片中每一个所述独立反应单元的光信号；
c)根据每次识别的所述载体芯片中的所述每一个独立反应单元的光信号，生成所述每一个独立反应单元的扩增曲线；
d)通过比对每次拍摄的所述每一个独立反应单元的光信号，或/和，所述每一个独立反应单元的所述扩增曲线的差异，判断并识别所述独立反应单元中的有效反应单元；
e)通过所述扩增终点的每一个所述有效反应单元的光信号，判断阳性扩增反应单元和阴性扩增反应单元个数。


2.根据权利要求1所述的实时数字PCR方法，其特征在于，所述载体芯片为具有多于100、1000或10000个微腔室的微流板，和/或使油包水液滴单层排列的微流板；其中，每一个所述微腔室或所述油包水液滴都作为一个所述独立反应单元。


3.根据权利要求1或2所述的实时数字PCR方法，其特征在于，所述待扩增样品加入到载体芯片中后，对加入所述待扩增样品后的所述载体芯片进行扩增反应前，还包括：
对所述载体芯片进行拍摄，并识别所述载体芯片中所述每一个独立反应单元的光信号。


4.根据权利要求1所述的实时数字PCR方法，其特征在于，所述通过所述扩增终点的每一个所述有效反应单元的光信号，判断阳性扩增反应单元和阴性扩增反应单元个数之后，还包括：
根据所述扩增曲线生成每一个所述有效反应单元的阈值循环数；根据所述阈值循环数判断每一个所述有效反应单元的模版个数并进行模版定量。


5.一种实时数字PCR装置，其特征在于，包括：
扩增模块，载体芯片位于所述扩增模块内时，所述载体芯片中携带的待扩增样品进行扩增反应；
成像模块，用于拍摄所述载体芯片；
获取模块，基于所述成像模块的拍摄结果，获取所述载体芯片中每一个独立反应单元的光信号；
判断模块，通过所述获取模块获取的所述载体芯片所述每一个独立反应单元的光信号，判断并识别所述载体芯片中的假阳性或假阴性扩增反应单元；
处理模块，...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐刚伟，吴东平，孙鹏，
申请(专利权)人：上海小海龟科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31