用于固定化酶的分级孔炭微球载体及其制备方法和应用技术

一种用于固定化酶的分级孔炭微球载体及其制备方法和应用，属于固定化酶领域。该用于固定化酶的分级孔炭微球载体具有介孔‑大孔两级孔结构，且介孔结构存在于大孔孔壁上，形成三维互通的孔结构；在其表面和孔内壁上存在含氧官能团；其介孔孔径为10‑50nm，大孔孔径为50<大孔孔径≤220nm，比表面积为306‑631m

Hierarchical porous carbon microsphere carrier for immobilization of enzyme and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
用于固定化酶的分级孔炭微球载体及其制备方法和应用
本专利技术属于固定化酶
，公开一种用于固定化酶的分级孔炭微球载体及其制备方法和应用。
技术介绍
固定化酶(immobilizedenzyme)是20世纪60年代发展起来的新技术，被广泛用于食品生产、生物制药、生物传感器、医药工业、环保技术及生物技术等多种领域，如何提高固定酶活性、稳定性，重复使用性及其可再生性一直是研究的重点及难点。其中，载体作为固定化酶的重要组成部分，其结构和性能对固定化酶的性能和应用均具有重要的影响。目前用于固定化酶的载体主要有无机材料、有机材料和无机有机复合材料，主要通过包埋法、吸附法、共价键结合法等将酶固定在载体上。包埋法只适合用于小分子底物和产物的酶催化反应；共价键结合法通常是通过酶分子表面氨基残基与载体上的活性基团的化学反应连接在一起，稳定性较好但会引起酶蛋白结构发生改变，使酶活性中心受损，进而导致酶活降低；吸附法操作简单，对于酶构象影响较小，但单纯的物理吸附法存在酶和载体相互作用较弱，酶易流失，稳定性较差等问题。因此如何控制固定化酶的微环境，提高固定化酶的固定化率和稳定性，是固定化酶
的发展方向。介孔炭材料的生物相容性好，无毒，物化性能稳定且具有丰富的孔结构，可为酶分子提供多点吸附和存储空间，而单一的介孔结构不利于大分子酶的吸附及酶和底物的接触，甚至可能造成阻塞现象。针对上述问题，设计具有介孔-大孔结构的分级孔炭材料，介孔结构为酶的吸附提供吸附位点及存储空间，大孔结构提高酶和底物的接触，利于传质过程，避免发生阻塞现象。利用炭材料表面官能团丰富易活化处理构建含氧官能团的特性，结合孔结构的控制协同提升固定化酶的稳定性及活性。此外相比于块状和粉体材料而言，炭微球外表光滑规整、流动性好、强度高、耐磨且易于回收，因此本专利技术公开的用于固定化酶的分级孔炭微球载体及其制备和应用，对于固定化酶的工业化应用推广具有重要意义。
技术实现思路
针对上述现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种用于固定化酶的分级孔炭微球载体及其制备方法和应用，该用于固定化酶的分级孔炭微球载体尤其适用于固定果胶酶，本专利技术的用于固定化酶的分级孔炭微球载体是一种微观孔结构和宏观球状形貌可控的分级孔炭微球，其具有介孔-大孔两级孔结构，且介孔结构存在于大孔孔壁形成三维互通的孔结构，其中介孔结构为酶的固定提供活性位点及存储空间，大孔结构利于底物和酶的接触和传质过程。本专利技术的用于固定化酶的分级孔炭微球载体的制备方法采用水热合成结合反向悬浮聚合法，再通过活性处理在炭微球表面及孔壁内构建含氧官能团，制备方法操作简单，成本较低，可控性强，重复性好。用本专利技术的用于固定化酶的分级孔炭微球载体固定果胶酶具有活性高、稳定性好、易回收等优点。本专利技术的一种用于固定化酶的分级孔炭微球载体，具有介孔-大孔两级孔结构，且介孔结构存在于大孔孔壁上，形成三维互通的孔结构；在用于固定化酶的分级孔炭微球载体的表面和孔内壁上存在含氧官能团；所述的用于固定化酶的分级孔炭微球载体的介孔孔径为10-50nm，大孔孔径为50<大孔孔径≤220nm，优选为80-220nm；比表面积为306-631m2/g。所述的用于固定化酶的分级孔炭微球载体的宏观粒径分布在0.5-3.0mm。所述的用于固定化酶的分级孔炭微球载体的制备方法，包括以下步骤：步骤1：溶解按摩尔比，称量各个物料；其中，按摩尔比，间苯二酚：P123表面活性剂：甲醛：盐酸：扩孔剂：蒸馏水：乙二醇＝1：(0.36-0.6)：2：(0.1-0.3)：(0-0.4)：86：(43-86)；将乙二醇和蒸馏水混合，得到乙二醇和蒸馏水的混合体系；将间苯二酚和P123表面活性剂溶解于乙二醇和蒸馏水的混合体系中，搅拌至溶液澄清，加入质量浓度为37％的盐酸水溶液，得到反应混合物；步骤2：预聚向反应混合物中加入质量浓度为37％的甲醛溶液后，再加入扩孔剂，在25-40℃进行搅拌预聚，得到预聚混合液；步骤3：聚合将预聚混合液置于含有石蜡油的反应釜中，在80-90℃搅拌聚合直至预聚混合液出现球状物质，搅拌速率为50-300r/min，得到球状聚合物；步骤4：炭化将球状聚合物老化2d后干燥，再在600-1000℃炭化1-5h，得到分级孔炭微球；所述的炭化气氛为氮气；步骤5：表面活性处理将分级孔炭微球置于表面改性溶剂中浸泡24h以上，取出洗涤至中性后干燥，在分级孔炭微球的表面和孔壁上构建含氧官能团，得到用于固定化酶的分级孔炭微球载体。所述的步骤1中，搅拌的搅拌速率为300-500r/min。所述的步骤2中，搅拌预聚时间为20-60min。所述的步骤2中，扩孔剂优选为TMB或PEG。所述的步骤3中，搅拌聚合时间优选为10-20min。所述的步骤3中，所述的反应釜优选为聚四氟反应釜。所述的步骤4中，干燥的温度为120-180℃，时间为24h以上。所述的步骤4中，制备的分级孔炭微球其结构完整，分级孔炭微球的宏观粒径为0.5-3mm。所述的步骤5中，表面改性溶剂根据含氧官能团类型确定，可以选用H2O2溶液或HNO3溶液。所述的H2O2溶液优选为10-30wt.％H2O2水溶液；所述的HNO3溶液优选为1-4mol/L的HNO3水溶液。本专利技术的用于固定化酶的分级孔炭微球载体的应用，为将其用于固定酶，优选为果胶酶。所述的固定酶的方法，包括以下步骤：步骤一：按配比，称量用于固定化酶的分级孔炭微球载体和酶，用缓冲液将酶配制成7-15U/mL的酶溶液；按质量比，用于固定化酶的分级孔炭微球载体：酶＝1：(2-5)；步骤二：将用于固定化酶的分级孔炭微球载体和酶溶液混合，进行振荡吸附反应，反应温度为25-45℃，反应时间为30-150min，振荡速率为100-200r/min，振荡吸附后，将振荡产物用缓冲液洗涤直到上清液中检测不到酶活为止，得到分级孔炭微球载体固定化酶，备用。所述的步骤一中，当酶为果胶酶时，缓冲液为柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液或醋酸缓冲液，其pH值为3-7。本专利技术制备的分级孔炭微球载体固定化酶，固定化酶的固定化率最高可达到90％，酶活回收率最高可达到92.84％，在4℃储存60d后固定化酶的残余酶活最高可达到80％以上。重复使用10次后固定化酶的残余酶活仍为90％。当本专利技术的固定酶为果胶酶时，得到的是分级孔炭微球载体固定化果胶酶。本专利技术的一种用于固定化酶的分级孔炭微球载体及其制备方法和应用，相比于现有技术，其有益效果在于：1、本专利技术的用于固定化酶的分级孔炭微球载体，存在介孔-大孔两级孔结构，且介孔存在于大孔孔壁上形成三维互通的孔结构。介孔结构为酶的固定提供多点吸附活性位和存储空间，控制吸附速率；大孔结构提高酶和底物的接触，更有利于传质过程。以蒸馏水和乙二醇为混合溶液，通过相分离原理形成大孔结构，嵌段共聚物P123在炭化本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于固定化酶的分级孔炭微球载体，其特征在于，该用于固定化酶的分级孔炭微球载体具有介孔-大孔两级孔结构，且介孔结构存在于大孔孔壁上，形成三维互通的孔结构；在用于固定化酶的分级孔炭微球载体的表面和孔内壁上存在含氧官能团；/n所述的用于固定化酶的分级孔炭微球载体的介孔孔径为10-50nm，大孔孔径为50<大孔孔径≤220nm，比表面积为306-631m

【技术特征摘要】
1.一种用于固定化酶的分级孔炭微球载体，其特征在于，该用于固定化酶的分级孔炭微球载体具有介孔-大孔两级孔结构，且介孔结构存在于大孔孔壁上，形成三维互通的孔结构；在用于固定化酶的分级孔炭微球载体的表面和孔内壁上存在含氧官能团；
所述的用于固定化酶的分级孔炭微球载体的介孔孔径为10-50nm，大孔孔径为50<大孔孔径≤220nm，比表面积为306-631m2/g。


2.根据权利要求1所述的用于固定化酶的分级孔炭微球载体，其特征在于，所述的用于固定化酶的分级孔炭微球载体的宏观粒径分布在0.5-3.0mm。


3.权利要求1或2所述的用于固定化酶的分级孔炭微球载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：溶解
按摩尔比，称量各个物料；其中，按摩尔比，间苯二酚：P123表面活性剂：甲醛：盐酸：扩孔剂：蒸馏水：乙二醇＝1：(0.36-0.6)：2：(0.1-0.3)：(0-0.4)：86：(43-86)；
将乙二醇和蒸馏水混合，得到乙二醇和蒸馏水的混合体系；
将间苯二酚和P123表面活性剂溶解于乙二醇和蒸馏水的混合体系中，搅拌至溶液澄清，加入质量浓度为37％的盐酸水溶液，得到反应混合物；
步骤2：预聚
向反应混合物中加入质量浓度为37％的甲醛溶液后，再加入扩孔剂，在25-40℃进行搅拌预聚，得到预聚混合液；
步骤3：聚合
将预聚混合液置于含有石蜡油的反应釜中，在80-90℃搅拌聚合直至预聚混合液出现球状物质，搅拌速率为50-300r/min，得到球状聚合物；
步骤4：炭化
将球状聚合物老化2d后干燥，再在600-1000℃炭化1-5h，得到分级孔炭微球；所述的炭化气氛为氮气；
步骤5：表面活性处理
将分级孔炭微球置于表面改性溶剂中浸泡24h以上，取出洗涤至中性后干燥，在分级孔炭微球的表面和孔壁上构建含氧官能团，得到用于固定化酶的分级孔炭微球载体。

【专利技术属性】
技术研发人员：徐昱峰，李拖平，宋婉莹，张佰清，张云鹤，张红艳，石琴，展喆，
申请(专利权)人：沈阳农业大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21