【技术实现步骤摘要】
一种在黄颡鱼中双gRNA位点敲除dmrt1基因的CRISPR/Cas9系统及应用
本专利技术涉及生物技术、遗传育种领域，尤其是一种在黄颡鱼中双gRNA位点敲除dmrt1基因的CRISPR/Cas9系统及应用。
技术介绍
黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)隶属硬骨鱼纲(Osteichthyes)、鲶形目(Siluriformes)、鲿科(Bagridae)、黄颡鱼属(Pelteobagrus)，是我国重要的淡水经济养殖鱼类之一。由于黄颡鱼雄鱼生长速度是雌鱼的2-3倍。近年来国内兴起全雄黄颡鱼养殖，但是随着黄颡鱼养殖业的快速发展，一些问题相继出现，例如，用于生产全雄苗的YY超雄鱼供应紧张，价格昂贵；另外由于近亲繁殖现象严重，导致黄颡鱼种质退化、生长速度降低、抗病抗逆性降低等。这严重制约了黄颡鱼养殖业的可持续发展，因此迫切的需要对黄颡鱼现有的种质进行提纯复壮，选育出遗传性状优良的纯系超雄鱼和全雌鱼。理解黄颡鱼性别决定和分化以及生殖调控机制是进行人工性别控制育种的基础。Dmrt(Doble-sex...
【技术保护点】
1.一种在黄颡鱼中双gRNA位点敲除dmrt1基因的CRISPR/Cas9系统，其特征在于，所述CRISPR/Cas9系统包括以下步骤：/n(1)靶位点1设计在黄颡鱼dmrt1基因第一外显子上，靶位点2设计在第三外显子上；/n(2)根据步骤(1)的靶位点序列设计引物检测亲鱼中靶位点的准确性，用dmrt1 E1 F和dmrt1 E1 R扩增靶位点1及附近序列，用dmrt1 E3 F和dmrt1 E3 R扩增靶位点2及附近序列；/n(3)以pUC19-gRNA-scaffold质粒为模板，用dmrt1 E1 gRNA F和gRNA R进行gRNA1片段的PCR扩增，用dmrt1...
【技术特征摘要】
1.一种在黄颡鱼中双gRNA位点敲除dmrt1基因的CRISPR/Cas9系统，其特征在于，所述CRISPR/Cas9系统包括以下步骤：
(1)靶位点1设计在黄颡鱼dmrt1基因第一外显子上，靶位点2设计在第三外显子上；
(2)根据步骤(1)的靶位点序列设计引物检测亲鱼中靶位点的准确性，用dmrt1E1F和dmrt1E1R扩增靶位点1及附近序列，用dmrt1E3F和dmrt1E3R扩增靶位点2及附近序列；
(3)以pUC19-gRNA-scaffold质粒为模板，用dmrt1E1gRNAF和gRNAR进行gRNA1片段的PCR扩增，用dmrt1E3gRNAF和gRNAR进行gRNA2片段的PCR扩增；以上述PCR产物为模板，体外转录并纯化获得gRNA；
(4)以pXT7-hCas9线性化质粒为模板，体外转录合成Cas9mRNA；
(5)将Cas9mRNA和两个gRNA显微注射到黄颡鱼一细胞期胚胎中；
(6)检测突变类型，计算基因编辑率。
2.根据权利要求1所述系统，其特征在于，步骤(1)中所述靶位点1序列为SEQIDNO.1所示的序列；所述靶位点2序列为SEQIDNO.2所示的序列。
3.根据权利要求1所述系统，其特征在于，步骤(2)中所述引物dmrt1E1F的序列为SEQIDNO.3所示的序列；所述引物dmrt1E1R的序列为SEQIDNO.4所示的序列；所述引物dmrt1E3F的序列为SEQIDNO.5所示的序列；所述引物dmrt1E3R的序列为SEQIDNO.6所示的序列。
4.根据权利要求1所述系统，其特征在于，步骤(3)中所述引物dmrt1E1gRNAF的序列为SEQIDNO.7所示的序列；所述引物dmrt1E3gRNAF的序列为SEQIDNO.8所示的序列；所述引物gRNAR的序列为SEQIDNO.9所示的序列。
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【专利技术属性】
技术研发人员：李石竹，卢建国，方文宇，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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