纤维二糖水解酶的突变体制造技术

本发明专利技术公开了一种纤维二糖水解酶的突变体，所述突变体是氨基酸序列为SEQ IDNO.1的纤维二糖水解酶在第133位、第165位和第183位中至少一个位点的氨基酸突变为丙氨酸。本发明专利技术通过对纤维二糖水解酶进行蛋白质工程改造，获得了突变蛋白。所述变体在相同条件下的酶活力更高，能大大提高纤维素的降解效率，进而促进在纤维素降解领域的应用。

Mutants of cellobiose hydrolase

【技术实现步骤摘要】
纤维二糖水解酶的突变体
本专利技术涉及酶基因工程改造
，具体涉及一种纤维二糖水解酶的突变体。
技术介绍
目前石油，天然气等化石燃料的储量日益减少，空气污染、气候变化的问题日益严峻，寻找和开发新的环境友好型能源受到越来越多的关注。木质纤维素是地球上含量最丰富的有机分子，也是一种可再生资源，从纤维素中有效地生成可发酵的水解产物，是利用木质纤维素原料生产具有成本竞争力的生物燃料和其他可持续生物基产品的主要要求之一。纤维素水解酶正是将纤维素转化为可利用能源的一个关键因素。人们对于纤维素水解酶的知识大多数来源于对里氏木霉的研究，里氏木霉的纤维素酶系统在生产生物乙醇的方面已经得到广泛的研究。里氏木霉甚至被宣布成为木质纤维素酶降解方面的工业标准。里氏木霉分泌包括至少5种内切葡聚糖酶(EGI–V,orCel7B,Cel5A,Cel12A,Cel61AandCel45A)，两种纤维二糖水解酶(CBHI,CBHIIorCel7A,Cel6A)和β-葡萄糖苷酶以及大量的木聚糖酶和至少一种β-木糖苷酶。纤维二糖水解酶(cellobiohydrolases,CBH,exoglucanase,E.C.3.2.1.91)，又被称为外切葡聚糖酶，分为CBHI和CBHⅡ，对纤维素末端表现出特异性，分别作用于纤维素链的还原端和非还原端，其中CBHI又被称为Cel7A，而CBHⅡ被称为Cel6A。在里氏木霉中Cel7A占到了整个纤维素酶系统总量的40％-70％，Cel7A可以水解结晶纤维素，产生纤维二糖。改造Cel7A，提高其酶活力，对于提高纤维素酶水解，有重要的产业前景。定点突变是指通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向目的DNA片段(可以是基因组，也可以是质粒)中引入所需变化，包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。目前已有关于采用定点突变的方式对Cel7A进行改造的报道，例如CN105176949A、CN104870641A、CN104870643A、CN104870642A、CN104870638A、CN104870644A、200480007562.3、200480008007.2等。然而，多数位点的定点突变对酶蛋白的高级结构变化不大，导致对酶功能的改造效果较为有限。因此，如何确定突变的位点以及突变的方向，是定向突变改造Cel7A的难点所在。需要说明的是，上述公开的
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本公开的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术的目的是提供一种纤维二糖水解酶的突变体，及其在木质纤维素降解中的应用。本专利技术通过对纤维二糖水解酶进行蛋白质工程改造，获得了突变蛋白。所述变体在相同条件下的酶活力更高，能大大提高纤维素的降解效率，进而促进在纤维素降解领域的应用。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一方面，提供一种纤维二糖水解酶的突变体，所述突变体是氨基酸序列为SEQIDNO.1的纤维二糖水解酶在第133位、第165位和第183位中至少一个位点的氨基酸突变为丙氨酸。优选的，所述纤维二糖水解酶的突变体为如下1)-4)任一项所述：1)突变体，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；2)突变体，其氨基酸序列如SEQIDNO.3所示；3)突变体，其氨基酸序列如SEQIDNO.4所示；4)突变体，其氨基酸序列如SEQIDNO.5所示。其中，SEQIDNO.2所示的突变体，是氨基酸序列为SEQIDNO.1的纤维二糖水解酶第133位氨基酸由T突变为A。SEQIDNO.3所示的突变体，是氨基酸序列为SEQIDNO.1的纤维二糖水解酶第165位氨基酸由S突变为A。SEQIDNO.4所示的突变体，是氨基酸序列为SEQIDNO.1的纤维二糖水解酶第183位氨基酸由K突变为A。SEQIDNO.5所示的突变体，是氨基酸序列为SEQIDNO.1的纤维二糖水解酶第133位氨基酸由T突变为A，第165位氨基酸由S突变为A，第183位氨基酸由K突变为A。更优选的，所述纤维二糖水解酶的突变体，其氨基酸序列如SEQIDNO.5所示。本专利技术的第二方面，提供编码上述纤维二糖水解酶的突变体的基因。本专利技术的第三方面，提供一种重组质粒，所述重组质粒携带编码上述纤维二糖水解酶的突变体的基因。本专利技术的第四方面，提供一种重组菌株，所述重组菌株是将所述的重组质粒转化入宿主菌中制备的。优选的，所述宿主菌为里氏木霉(Trichodermareesei)。上述重组质粒或重组菌株在生产纤维二糖水解酶中的应用也是本专利技术的保护范围。本专利技术的第三方面，提供扩增上述基因的引物组，所述引物组包括：序列表中SEQIDNO.6和SEQIDNO.7所示的引物对、SEQIDNO.8和SEQIDNO.9所示的引物对以及SEQIDNO.10和SEQIDNO.11所示的引物对。本专利技术的第四方面，提供上述突变体或编码突变体的基因在纤维素降解产物生产中的的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术以保藏编号为CCTCCNO:M2015804的里氏木霉Trichdermareesei所产的Cel7A为出发酶，将该出发酶的第133位、第165位和第183位中至少一个位点的氨基酸突变为丙氨酸，获得纤维二糖水解酶的突变体。经本专利技术的方法改造的Cel7A，相比出发菌株所产的Cel7A的酶活效率更高。本专利技术方法改造的里氏木霉突变体所产酶液的降解纤维素的水解能力均高于出发菌株。将该改造方法应用于纤维素酶的改造，使其可以生产具有更高活性的纤维素酶，在同样培养成本的条件下大规模提高了外切酶的活性，具有良好的经济意义。附图说明图1：用于点突变的质粒图谱。具体实施方式应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。正如
技术介绍
中所介绍的，改造Cel7A，提高其酶活力，对于提高纤维素酶水解，有重要的产业前景。对天然酶分子进行改造的方法主要有化学修饰、定点突变、定向进化和基因融合等，其中，酶的定点突变是在已知的DNA序列中替换、插入或缺失一定长度碱基，从而改变酶催化性质的一种方法。但多数位点的定点突变对酶蛋白的高级结构变化不大，导致对酶功能的改造效果较为有限。因此，如何确定突变的位点以及突变的方向，是定向突变改造Cel7A的难点所在。本专利技术是以CCTCCNO:M2015804的里氏木霉Trichdermareesei所产的Cel7A为出发酶，该酶的空间三维结构以及蛋白质结构与功能之间的关系目前并没有相关报道，因此，进一步增加了对该酶进行定点突变的难度。本专利技术在酶的改造过程中，还针对Cel7A其他多个突变位本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种纤维二糖水解酶的突变体，其特征在于，所述突变体是氨基酸序列为SEQ IDNO.1的纤维二糖水解酶在第133位、第165位和第183位中至少一个位点的氨基酸突变为丙氨酸。/n

【技术特征摘要】
1.一种纤维二糖水解酶的突变体，其特征在于，所述突变体是氨基酸序列为SEQIDNO.1的纤维二糖水解酶在第133位、第165位和第183位中至少一个位点的氨基酸突变为丙氨酸。


2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述纤维二糖水解酶的突变体为如下1)-4)任一项所述：
1)突变体，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；
2)突变体，其氨基酸序列如SEQIDNO.3所示；
3)突变体，其氨基酸序列如SEQIDNO.4所示；
4)突变体，其氨基酸序列如SEQIDNO.5所示。


3.根据权利要求2所述的突变体，其特征在于，所述纤维二糖水解酶的突变体，其氨基酸序列如SEQIDNO.5所示。


4.编码权利要求1-3任一项所述的突变体的基因。


5.一种重组质粒，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：方诩，刘正垚，杜志强，
申请(专利权)人：荣成市慧海创达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37