评价杀虫蛋白对异色瓢虫幼虫影响的方法技术

本发明专利技术提供一种评价杀虫蛋白对异色瓢虫幼虫影响的方法，本方法适用范围广，对能够溶于异色瓢虫幼虫人工饲料的具有胃毒、内吸作用的杀虫蛋白或其他化学组分均能够进行有效测定，幼虫可以通过直接取食人工饲料而接触到不同剂量的有害物质。明确评价杀虫蛋白对异色瓢虫幼虫影响的评价指标，除比较幼虫存活率、幼虫体重外，还将总蛋白酶、羧酸酯酶、谷胱甘肽‑S‑转移酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶等重要解毒和保护酶的酶活力作为评价指标，可以更加全面的评价杀虫蛋白对幼虫的影响。此外，本方法还同时确定了阳性对照物质，保证了生测体系评价结果的有效性，因此能够准确地评价杀虫蛋白对异色瓢虫幼虫的影响。

A method to evaluate the effect of insecticidal protein on the larvae of Coccinella axyridis

【技术实现步骤摘要】
评价杀虫蛋白对异色瓢虫幼虫影响的方法
本专利技术属于植物保护
，具体地说，涉及一种评价杀虫蛋白对异色瓢虫幼虫影响的方法。
技术介绍
异色瓢虫(Harmoniaaxyridis)属鞘翅目(Coleoptera)瓢虫科(Coccinellidae)，除能捕食蚜虫、盲蝽、粉虱等刺吸式昆虫外，还能捕食鳞翅目害虫卵和低龄幼虫。因其具有个体大、移动能力强和食量大等特点，相较其他瓢虫，其捕食能力在农田生态系统中占有显著优势，是一种非常重要的天敌资源。因此，异色瓢虫常被作为评价生态环境安全性的重要指示性物种。转基因抗虫植物对一些重要农林害虫有很好的控制作用，但其潜在的环境安全性问题也一直是大家关注的问题，如转基因植物对非靶标生物和天敌的可能的潜在影响等。异色瓢虫的幼虫和成虫在田间通过捕食取食抗虫植物的害虫而能够间接接触到植物中表达的杀虫蛋白。因此，如果转基因抗虫植物中表达的杀虫蛋白对异色瓢虫幼虫存在显著影响，那么该种抗虫植物的推广种植就会削弱异色瓢虫对农田害虫的控制作用。在田间可以通过种群调查等可以评价杀虫蛋白的影响，但田间种群的变化受多种因素的影响，且不能进行定量评价。因此，室内建立适合的准确评价杀虫物质对异色瓢虫幼虫影响的方法具有十分重要的意义。以往评价有毒物质对异色瓢虫幼虫毒性的方法，如浸液接虫法、滤纸接触法、药膜法等，对于具有胃毒作用的杀虫物质如Bt杀虫蛋白的毒性测定则具有一定的局限性，由此这些方法不能保证供试瓢虫幼虫能够接触到足够剂量的有毒物质。且这些方法适合用于评价速效的杀虫蛋白的影响，对于评价毒性不大、见效慢的杀虫蛋白对异色瓢虫幼虫的长期影响不适用。因此亟待开发一套科学、系统且准确性高的评价杀虫蛋白对异色瓢虫幼虫影响的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种评价杀虫蛋白对异色瓢虫幼虫影响的方法。为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种评价杀虫蛋白对异色瓢虫幼虫影响的方法，该方法采用生物测定结合解毒酶和保护酶的活性测定，构建评价体系。包括以下步骤：1)将待测杀虫蛋白以一定浓度添加到异色瓢虫幼虫的人工饲料中作为实验组，以不含其它添加成分的人工饲料作为阴性对照组，以含有对异色瓢虫幼虫生长具有明显抑制作用的物质的人工饲料作为阳性对照组；各组饲料分别用封口膜包裹好，形成密封的饲料囊；2)将各组饲料囊分别置于含有水源的养虫箱内，然后将初孵异色瓢虫幼虫放入各养虫箱内，第一天用养虫箱内的饲料囊饲喂异色瓢虫幼虫，第二天用养虫箱内的饲料囊和蚕豆蚜混合饲喂，之后照此方法交替进行饲喂；3)饲喂14-15天(优选15天)后，分别统计各组的存活幼虫数，称量存活幼虫体重，并测定虫体的蛋白酶活力；4)对步骤3)获得的统计数据进行分析，根据分析结果判定待测杀虫蛋白对异色瓢虫幼虫的影响。前述的方法，步骤1)中所述对异色瓢虫幼虫生长具有明显抑制作用的物质为半胱氨酸蛋白酶抑制剂或砷酸二氢钾(KH2AsO4，PA)。优选地，所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂为N-[反式-环氧丁二酰基]-L-亮氨酸-4-胍基丁基酰胺(E-64)。更优选地，以含有400μg/g半胱氨酸蛋白酶抑制剂的人工饲料作为阳性对照组。前述的方法，步骤2)中将浸水的棉球作为水源。前述的方法，异色瓢虫幼虫的饲养条件为：温度27℃±2℃，湿度75％±5％，光照14h，黑暗10h。前述的方法，步骤3)中所述蛋白酶选自总蛋白酶、羧酸酯酶、谷胱甘肽-S-转移酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶等中的至少一种。前述的方法，步骤4)中结果判定如下：如果实验组幼虫死亡率与对照组存在显著差异，说明待测杀虫蛋白对异色瓢虫幼虫存在显著影响；如果实验组幼虫死亡率与阴性对照组差异不显著，但实验组幼虫的平均体重显著低于阴性对照组，或蛋白酶的活力显著低于阴性对照组，也表明待测杀虫蛋白对异色瓢虫幼虫有显著影响。本专利技术中，异色瓢虫幼虫的人工饲料可参照草蛉的人工饲料配制方法进行配制(参见Lee,K.S.等，2005；Li,Y.等，2014)。本专利技术中，所述杀虫蛋白可以是对瓢虫等天敌生存或生长有明显影响的杀虫蛋白，也可以是对其只有微弱影响的蛋白。本方法同样适用于其他捕食性瓢虫的杀虫蛋白对其幼虫影响的评价。借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：本专利技术提供一种评价杀虫蛋白对异色瓢虫幼虫影响的新方法，该方法适用范围广，对能够溶于异色瓢虫幼虫人工饲料的具有胃毒、内吸作用的杀虫蛋白或其他化学组分均能够进行有效测定，幼虫可以通过直接取食人工饲料而接触到不同剂量的有害物质。明确评价杀虫蛋白对异色瓢虫幼虫影响的评价指标，除比较幼虫存活率、幼虫体重外，还将总蛋白酶、羧酸酯酶、谷胱甘肽-S-转移酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶等重要解毒和保护酶的酶活力作为评价指标，可以更加全面的评价杀虫蛋白对幼虫的影响。此外，该生测方法还同时确定了阳性对照物质，保证了生测体系评价结果的有效性，因此能够准确地评价杀虫蛋白对异色瓢虫幼虫的影响。附图说明图1为本专利技术实施例1中取食Cry2Ah对异色瓢虫幼虫体内主要酶活性的影响。图2为本专利技术实施例2中取食Cry1Ac对异色瓢虫幼虫体内主要酶活性的影响。图1～图2中，A：总蛋白酶活性，B：羧酸酯酶，C：谷胱甘肽-S-转移酶，D：过氧化物酶，E：超氧化物歧化酶。具体实施方式本专利技术提供一种评价杀虫蛋白对异色瓢虫幼虫影响的方法，包括如下步骤：1、将异色瓢虫幼虫人工饲料准备好后，与一定浓度的待测杀虫蛋白混合均匀，用拉伸至原来尺寸2-3倍的封口膜包裹0.2ml人工饲料，之后将封口膜对折并将边缘捏紧包裹成大小一致的饲料胶囊提供给幼虫；以不添加其他任何化学成分的人工饲料作为阴性对照，以含有400μg/g半胱氨酸蛋白酶抑制剂(N-[反式-环氧丁二酰基]-L-亮氨酸-4-胍基丁基酰胺，E-64)的异色瓢虫处理饲料作为阳性对照；2、在塑料养虫皿中接入一头异色瓢虫初孵幼虫，皿中放置一个浸有水的脱脂棉球作为水源，盖上养虫皿盖子，置于温度27℃±2℃，湿度75％±5％，光照14h，黑暗10h的环境条件下进行培养；试验开始第一天，幼虫用不同处理饲料囊饲喂，第二天用饲料囊和蚕豆蚜混合饲喂，之后照此方法重复交替进行；3、饲喂14-15天后，统计各处理的存活幼虫数、称量存活幼虫体重，测定总蛋白酶、羧酸酯酶、谷胱甘肽-S-转移酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶的活力；4、对各处理的幼虫存活率、幼虫平均体重、酶活力等数据进行方差分析，根据结果判定杀虫蛋白对异色瓢虫幼虫是否存在影响。如果处理组幼虫死亡率与对照存在显著差异，说明杀虫蛋白对异色瓢虫幼虫存在显著影响；如果幼虫死亡率差异不显著，但处理组幼虫的平均体重显著低于对照，或总蛋白酶、羧酸酯酶、谷胱甘肽-S-转移酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶等重要解毒酶和保护酶的酶活力显著低于对照，也表明杀虫蛋白对异色瓢虫幼虫有显著影响。以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.评价杀虫蛋白对异色瓢虫幼虫影响的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)将待测杀虫蛋白以一定浓度添加到异色瓢虫幼虫的人工饲料中作为实验组，以不含其它添加成分的人工饲料作为阴性对照组，以含有对异色瓢虫幼虫生长具有明显抑制作用的物质的人工饲料作为阳性对照组；各组饲料分别用封口膜包裹好，形成密封的饲料囊；/n2)将各组饲料囊分别置于含有水源的养虫箱内，然后将初孵异色瓢虫幼虫放入各养虫箱内，第一天用养虫箱内的饲料囊饲喂异色瓢虫幼虫，第二天用养虫箱内的饲料囊和蚕豆蚜混合饲喂，之后照此方法交替进行饲喂；/n3)饲喂14-15天后，分别统计各组的存活幼虫数，称量存活幼虫体重，并测定虫体的蛋白酶活力；/n4)对步骤3)获得的统计数据进行分析，根据分析结果判定待测杀虫蛋白对异色瓢虫幼虫的影响。/n

【技术特征摘要】
1.评价杀虫蛋白对异色瓢虫幼虫影响的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将待测杀虫蛋白以一定浓度添加到异色瓢虫幼虫的人工饲料中作为实验组，以不含其它添加成分的人工饲料作为阴性对照组，以含有对异色瓢虫幼虫生长具有明显抑制作用的物质的人工饲料作为阳性对照组；各组饲料分别用封口膜包裹好，形成密封的饲料囊；
2)将各组饲料囊分别置于含有水源的养虫箱内，然后将初孵异色瓢虫幼虫放入各养虫箱内，第一天用养虫箱内的饲料囊饲喂异色瓢虫幼虫，第二天用养虫箱内的饲料囊和蚕豆蚜混合饲喂，之后照此方法交替进行饲喂；
3)饲喂14-15天后，分别统计各组的存活幼虫数，称量存活幼虫体重，并测定虫体的蛋白酶活力；
4)对步骤3)获得的统计数据进行分析，根据分析结果判定待测杀虫蛋白对异色瓢虫幼虫的影响。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述对异色瓢虫幼虫生长具有明显抑制作用的物质为半胱氨酸蛋白酶抑制剂或砷酸二氢钾。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂为N-...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁革梅，赵曼，牛琳琳，陈琳，张彩虹，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11