枯草芽孢杆菌发酵产黄芩素的方法以及发酵制备的饲料添加剂和制备方法技术

本发明专利技术公布了一种枯草芽孢杆菌发酵产黄芩素的方法以及发酵制备的饲料添加剂和制备方法。所用益生菌株为枯草芽孢杆菌菌种保藏编号：CCTCC NO：M2019271，分离自健康鸡肠道内容物。首先，对枯草芽孢杆菌进行液体发酵，并采用液体发酵后期调控温度兼酸碱度的方法，提升了枯草芽孢杆菌活菌数和黄芩素含量，枯草芽孢杆菌活菌数达到148.5×10

The method of baicalein production by Bacillus subtilis, feed additive and preparation by fermentation

【技术实现步骤摘要】
枯草芽孢杆菌发酵产黄芩素的方法以及发酵制备的饲料添加剂和制备方法
本专利技术涉及微生物发酵、中草药转化和畜禽养殖应用
，尤其涉及一种枯草芽孢杆菌发酵产黄芩素的方法以及发酵制备的饲料添加剂和制备方法，还包括添加剂的应用方法。
技术介绍
近年来，在畜禽养殖业现代化、规模化的运行模式下，抗生素等在饲料中普遍使用，一方面，预防病菌感染，促进动物生产性能充分发挥，对畜牧业集约化发展做出了重大贡献；另一方面，破坏肠道正常菌群平衡，引起内源性及二重感染，严重导致畜禽产品及环境药物残留。当前，随着饲料中抗生素的全面禁止，迫切需要一种新的替代品，目前，中草药和微生态制剂在畜禽养殖业的应用，已成为国内外学者研究的一个热点，其大规模的开发将对发展绿色养殖，满足人们对食品的安全要求，具有重要的、潜在的生态和社会效益。黄芩中含有的主要成分为黄芩苷，其次为黄芩素、汉黄芩苷和汉黄芩素，具有多种药理活性，包括抗炎、抗氧化、抗微生物、抗病毒、清除自由基等。黄芩苷不易被动物机体直接吸收，需经肠道菌群作用水解成苷元黄芩素后，才能发挥其药效作用，同时大量临床药效实验证明，黄芩素属于黄酮类化合物，其药理作用强于黄芩苷。由于黄芩中游离型苷元(黄芩素)的含量很低(约1％)，主要以结合型的糖苷(黄芩苷)形式存在(含量大于10％)，游离型苷元远不能满足市场需求和临床应用。因此，将黄芩苷转化为黄芩素，提高其药理活性具有重大的实际意义。目前，黄芩素的提取大多是从药材中直接提取，近年来虽有一些文献报道利用侧耳菌、黑曲霉、米曲霉、青霉、纳豆芽孢杆菌、短乳杆菌对黄芩进行生物转化，并研究认为短乳杆菌葡聚糖酶(转化黄芩苷为黄芩素)属于糖苷水解酶30家族，上述转化过程中，所用菌种也多属真菌类，难免会产生安全性问题，而作为益生菌的纳豆芽孢杆菌，却非肠源固有土著菌种，在动物肠道中能否定殖、发挥益生作用还不明确。β-葡萄糖醛酸苷酶(β-glucuronidase，GUSB)，是一种糖苷类水解酶，多属于糖基水解酶家族2和糖基水解酶家族79，催化各种类型的β-葡萄糖醛酸苷水解产生多种衍生物，在β-葡萄糖醛酸苷酶的催化下，可定向水解黄芩苷为黄芩素。枯草芽孢杆菌菌株(菌种保藏编号：CCTCCNO：M2019271)为本申请人从健康鸡肠道内容物中筛选出的一株高产β-葡萄糖醛酸苷酶的益生菌菌株，具有天然的耐受胃肠道优势，自身能够发挥益生功效，同时在发酵过程中能够转化黄芩苷生产活性产物黄芩素，双重功效为在畜禽绿色养殖领域开发协同联用的益生菌、黄芩素混合型饲料添加剂提供了技术突破。现有技术中也有一些关于枯草芽孢杆菌发酵的研究。比如：本申请人前期研究并发表的论文“饲用枯草芽孢杆菌JY24发酵条件的优化”，贵州农业科学2019，47(10)：60-65，采用单因素试验与正交试验相结合的方法筛选JY24菌株摇瓶培养条件和培养基成分，并在此基础上优化培养基成分。结果表明：JY24菌株发酵条件为转速240r.min-1，温度35℃，初始pH7.0，装液量10％，接种量3％，发酵时间36h；最佳培养基组成为蔗糖12.0g/L+酵母膏12.0g/L+磷酸二氢钾1.25g/L+氯化钙0.22g/L+硫酸镁0.30g/L。在此条件下，发酵液活菌数达1.73×1010CFU.mL-1。但经过本申请人进一步研究发现，该论文中的培养条件和培养基组成并不适合于本专利技术利用枯草芽孢杆菌发酵产黄芩素的技术方案中。因此，本申请人重新对枯草芽孢杆菌发酵高效产黄芩素及其工艺调控进行了深入研究，取得了突破性进展。还有龙厚宁等2015年第23期《中国中药杂志》，公开发表了“纳豆菌液体发酵黄芩药材制备黄芩苷和汉黄芩苷的工艺”，得到液体发酵最佳工艺为蛋白胨质量分数为1.0％，氯化钠0.05％，pH6.0，黄芩药材粉碎过40目，装样量33％，摇床转速200r.min-1，液料比5:1，温度37℃，发酵6d，黄芩药材中黄芩苷的转化率为97.6％，汉黄芩苷转化率97.0％。当前，益生菌在人类、水产和畜禽养殖领域广泛应用，效果显著，黄芩素在人类医学临床应用上效果显著，水养上有定果但畜养中见道本专利技术开发出一种益生菌、黄芩素混合型饲料添加剂的生产方法，生产的益生菌、黄芩素混合型饲料添加剂经肉鸡饲喂试验，对肉鸡生长性能、免疫性能和抗氧化性能效果显著，该益生菌、黄芩素混合型饲料添加剂的大规模开发，将为我国畜禽养殖业和绿色生态农业带来无限生机。
技术实现思路
本专利技术的首要目的是提供一种枯草芽孢杆菌发酵产黄芩素的方法。该方法是首次针对单一的枯草芽孢杆菌，以及在培养基中单一添加黄芩这一种中药材发酵产黄芩素的研究。该方法不仅能够高效产黄芩素，而且产物中枯草芽孢杆菌的浓度也非常高，获得了具备高含量微生物和中药有效成分双重功效的发酵液。枯草芽孢杆菌发酵产黄芩素的方法，具体包括以下步骤：1)液体发酵液体发酵培养基配制：黄芩粉90-110g，蔗糖4.0-8.0g，酵母膏7.0-9.0g，磷酸二氢钾1.00-1.50g，无水氯化钙0.14-0.30g，七水硫酸镁0.20-0.40g，水加至1000mL，初始pH＝6.5-7.5。发酵罐中培养基的装量占发酵罐体积的40-60％，种子液按照培养基体积的3-5％接种，发酵罐发酵参数为温度34-35℃、转速200-240r.min-1、通气量(无菌空气)11.0-15.0L.min-1，发酵时间为34-38h；2)液体发酵后期调控温度兼酸碱度步骤(1)完成后，调控发酵温度为37-38℃，同时调控发酵液pH值恒定为6.0-7.0，继续发酵32-40h，转速200-240r.min-1、通气量(无菌空气)11.0-15.0L.min-1。本专利技术在枯草芽孢杆菌发酵产黄芩素的技术方案中首次使用两段发酵法，极大的提升了反应的效率，且产物中微生物和黄芩素含量较高。进一步的，所述的枯草芽孢杆菌发酵产黄芩素的方法，黄芩粉优选粉碎至40-80目，进一步优选粉碎至60目。黄芩粉碎到一定细度，增大了黄芩中黄芩苷底物与发酵液中枯草芽孢杆菌代谢产生的β-葡萄糖醛酸苷酶的接触面积，有利于促进黄芩苷的酶解产生黄芩素。进一步的，所述的枯草芽孢杆菌发酵产黄芩素的方法，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)优选为保藏编号：CCTCCNO：M2019271的枯草芽孢杆菌JY24。当然也不仅仅限于该保藏编号的枯草芽孢杆菌，一般具有较好的产β-葡萄糖醛酸苷酶作用的枯草芽孢杆菌亦可。进一步的，本专利技术所述的枯草芽孢杆菌发酵产黄芩素的方法，步骤1)液体发酵完成后菌体量达115.0－133.0×108CFU.mL-1，黄芩素含量达2.75－3.26mg.mL-1。进一步的，本专利技术所述的枯草芽孢杆菌发酵产黄芩素的方法，步骤2)发酵完成后菌体量达129-148.5×108CFU.mL-1，黄芩素含量达5.44－6.48mg.mL-1。本专利技术的第二个目的是提供枯草芽孢杆菌发酵产黄芩素制备饲料添加剂的方法。该方法是直接将上述本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.枯草芽孢杆菌发酵产黄芩素的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：/n1)液体发酵/n液体发酵培养基配制：黄芩粉90-110g，蔗糖4.0-8.0g，酵母膏7.0-9.0g，磷酸二氢钾1.00-1.50g，无水氯化钙0.14-0.30g，七水硫酸镁0.20-0.40g，水加至1000mL，初始pH＝6.5-7.5；/n发酵罐中培养基的装量占发酵罐体积的40-60％，种子液按照培养基体积的3-5％接种，发酵罐发酵参数为温度34-35℃、转速200-240r.min

【技术特征摘要】
1.枯草芽孢杆菌发酵产黄芩素的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
1)液体发酵
液体发酵培养基配制：黄芩粉90-110g，蔗糖4.0-8.0g，酵母膏7.0-9.0g，磷酸二氢钾1.00-1.50g，无水氯化钙0.14-0.30g，七水硫酸镁0.20-0.40g，水加至1000mL，初始pH＝6.5-7.5；
发酵罐中培养基的装量占发酵罐体积的40-60％，种子液按照培养基体积的3-5％接种，发酵罐发酵参数为温度34-35℃、转速200-240r.min-1、通气量11.0-15.0L.min-1，发酵时间为34-38h；
2)液体发酵后期调控温度兼酸碱度
步骤(1)完成后，调控发酵温度为37-38℃，同时调控发酵液pH值恒定为6.0-7.0，继续发酵32-40h，转速200-240r.min-1、通气量11.0-15.0L.min-1。


2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌发酵产黄芩素的方法，其特征在于，黄芩粉粉碎至40-80目。


3.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌发酵产黄芩素的方法，其特征在于，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)为保藏编号：CCTCCNO：M2019271的枯草芽孢杆菌JY24。


4.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌发酵产黄芩素的方法，其特征在于，步骤1)液体发酵完成后菌体量达115.0-133.0×108CFU.mL-1，黄芩素含量达2.75－3.26mg.mL-1；步骤2)发酵后期温度和酸碱度调控完成继续发酵后，...

【专利技术属性】
技术研发人员：高书锋，孔利华，雷平，刘惠知，王升平，周映华，龚平，曾发姣，缪东，周小玲，曾奥，舒燕，邬理洋，陈娴，胡丹，
申请(专利权)人：湖南省微生物研究院，
类型：发明
国别省市：湖南;43