一种复杂受试物对皮肤致敏性的预测方法技术

本发明专利技术公开了一种复杂受试物对皮肤致敏性的预测方法，包括以下步骤：(1)直接多肽结合试验改良分析和(2)人细胞系活化试验分析，当直接多肽结合试验改良分析和人细胞系活化试验分析结果均为致敏性时，所述复杂受试物预测结果为致敏性，当直接多肽结合试验改良分析和人细胞系活化试验分析结果均为非致敏性时，所述复杂受试物预测结果为非致敏性。该方法对直接多肽结合试验进行了改良，将改良后的直接多肽结合试验与人细胞活化试验相结合，用于复杂受试物对皮肤致敏性的预测，该方法比单一试验方法预测的正确率更高，有助于发现具有潜在致敏风险的复杂体系，实现复杂受试物的快速、有效筛查，还能节约时间和人力成本。

A prediction method of skin sensitization of complex test substance

【技术实现步骤摘要】
一种复杂受试物对皮肤致敏性的预测方法
本专利技术属于皮肤致敏物质检测
，具体涉及一种复杂受试物对皮肤致敏性的预测方法。
技术介绍
过敏性接触性皮炎(allergiccontactdermatitis,ACD)是皮肤重复接触某种外源物质产生的免疫介导的皮肤反应。通常会造成皮肤出现红，肿，痒，痛等情况，严重时会影响生物质量。因此，与皮肤接触或者将与皮肤多次接触的物质都有必要进行皮肤致敏测试，以确保皮肤接触物质，如化学品、日化产品和其他皮肤接触产品，在使用前有完善的风险评估和毒性评价。因此，安全是非常重要的一个环节，而这也是消费大众所需求的。用于皮肤致敏评估的传统方法是豚鼠试验和小鼠局部淋巴结实验(locallymphnodeassay,LLNA)。由于欧盟等国家已经禁止化妆品及化妆品组份的动物试验，因此替代实验的需求越来越大。同时，有害结局通路(adverseoutcomepathway,AOP)的概念被提出，开始采用人来源的组织或细胞进行毒理学效应的研究。皮肤致敏AOP通路，其分子起始事件是外源物质与皮肤蛋白共价结合形成半抗原，随后触发2个细胞水平的关键事件，即角质细胞炎症反应和树突状细胞的关键事件，即角质细胞炎症反应和树突状细胞的激活。其后，活化的树突状细胞迁移至局部淋巴结，将部分半抗原化学物转至初始型T淋巴细胞，最终导致记忆T细胞的增殖和分化这一组织水平关键事件的发生。当皮肤再次接触致敏物时进入激发阶段，导致ACD的有害结局。基于该AOP框架建立的直接多肽结合试验(directpeptidereactivityassay,DPRA)，角质细胞ARE-Nrf2荧光素酶检测方法(KeratinoSensTM)和人细胞活化试验(humancelllineactivationtest,h-CLAT)已被OECD认可为标准方法。皮肤致敏的替代方法主要针对AOP通路中的不同关键事件点建立评估方式，单一方法存在局限性，且预测精确度可能低于体内LLNA法。因此，尝试建立多种替代方法的组合模型以减少单一方法的不足是下一步研究的热点，目前，OECD共有12个针对化学品的皮肤致敏组合方案，但却没有针对复杂受试物如植物提取物这样的复杂体系的皮肤致敏组合方案。植物提取物由于原料获取多样、提取工艺和组份复杂不可避免地具有致敏性，其它非单一组分的物质也并不能保证没有致敏性，因此可以采用组合模型对复杂体系进行初步筛查，以提高皮肤致敏判断的效率和准确性。DPRA和h-CLAT两种方法的简单组合，用于化学物质的致敏能力初筛极为方便，但DPRA并不适用于复杂体系，需要进行改进或改良。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种复杂受试物对皮肤致敏性的预测方法，该方法对直接多肽结合试验(DPRA)进行了改良，将改良后的直接多肽结合试验与人细胞活化试验(h-CLAT)相结合，用于复杂受试物对皮肤致敏性的预测，该方法比单一试验方法预测的正确率更高，有助于发现具有潜在致敏风险的复杂体系，实现复杂受试物的快速、有效筛查，还能节约时间和人力成本。本专利技术的上述目的是通过如下技术方案来实现的：一种复杂受试物对皮肤致敏性的预测方法，包括以下步骤：(1)直接多肽结合试验改良分析(1.1)样品制备：建立对照组和复杂受试物组，其中对照组包括半胱氨酸多肽母液750μL、乙腈200μL和复杂受试物溶解溶剂50μL，复杂受试物组包括磷酸缓冲液与半胱氨酸多肽母液750μL、乙腈200μL和一系列不同浓度的复杂受试物50μL，其中半胱氨酸多肽母液的浓度为0.35-0.5mg/mL；(1.2)样品孵育：将对照组和复杂受试物组置于25±2.5℃暗处孵育24±2小时备用；(1.3)样品检测：将步骤(1.2)中孵育后的样品，采用液相色谱仪分析；(1.4)结果分析：计算样品的多肽消耗百分率，并用以进行致敏等级判断；(1.5)致敏性预测模型：0％≤多肽消耗百分率≤13.89％，所述复杂受试物为非致敏物，多肽消耗百分率＞13.89％，所述复杂受试物为致敏物；(2)人细胞系活化试验分析(2.1)细胞铺板：选取THP-1细胞，预处理后待用；(2.2)复杂受试物暴露：选取复杂受试物，按比例稀释后获得一系列浓度，加入步骤(2.1)中的THP-1细胞中，培育后待用；(2.3)阻断：在步骤(2.2)培育后的细胞中加入FcR阻断剂进行阻断；(2.4)CD86/CD54表达检测：在步骤(2.3)阻断后细胞中加入FITC-CD86抗体、PE-CD54抗体、FITC标记的小鼠同型对照IgG1和PE标记的小鼠同型对照IgG1，形成受试物处理组和受试物处理组同型对照，培育后采用流式细胞仪检测蛋白标志物；(2.5)数据处理：利用流式细胞仪检测相对荧光强度值RFI；(2.6)预测模型：在细胞活率大于50％前提下，对于FITC-CD86，若RFICD86≥150，所述复杂受试物为致敏物；对于PE-CD54，若RFICD54≥200，所述复杂受试物为致敏物，即当RFICD86≥150和/或RFICD54≥200时，所述复杂受试物为致敏物，其余情况则为非致敏物；(3)结果预测当步骤(1)中直接多肽结合试验改良分析和步骤(2)中人细胞系活化试验分析结果均为致敏性时，所述复杂受试物预测结果为致敏性，当步骤(1)中直接多肽结合试验改良分析和步骤(2)中人细胞系活化试验分析结果均为非致敏性时，所述复杂受试物预测结果为非致敏性。在上述复杂受试物对皮肤致敏性的预测方法中：优选地，步骤(1.1)中所述复杂受试物为非单一组分体系，包括但不限于非单一组分化学品、化妆品原料、化妆品产品、石油润滑剂、植物提取物、家用洗涤产品、皮肤科药品、生物活性原料、灰尘颗粒、空气污染物纺织品以及纺织品浸提液。进一步地，所述复杂受试物为非单一组分体系，该非单一组分体系还可以包括其它皮肤接触产品。更优选地，步骤(1.1)中所述复杂受试物为植物提取物。优选地，步骤(1.1)中所述复杂受试物溶解溶剂为乙腈、水、异丙醇、丙酮和二甲亚砜中的一种或几种。更优选地，步骤(1.1)中所述复杂受试物溶解溶剂为乙腈。推荐地，步骤(1.1)中复杂受试物优先选择乙腈作为溶剂，如果不溶解，可以尝试溶于水、1：1(体积比)水和乙腈、异丙醇，丙酮，1：1丙酮和乙腈(体积比)，或者溶于二甲亚砜后用乙腈稀释，也可进一步采用超声处理。优选地，步骤(1.1)中一系列不同浓度的复杂受试物的浓度为1000mg/mL、500mg/mL、250mg/mL、100mg/mL和10mg/mL。优选地，步骤(1.1)中所述半胱氨酸多肽母液是将半胱氨酸多肽采用磷酸缓冲溶液或体积比为4:1的磷酸缓冲溶液与乙腈的混合液配制而成。优选地，半胱氨酸多肽的结构为Ac-RFAACAA-COOH，纯度为90％-100％。优选地，所述磷酸缓冲溶液可以是pH＝7.5±0.5、浓度为100mmol/L的磷酸缓冲液。进一步本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种复杂受试物对皮肤致敏性的预测方法，其特征是包括以下步骤：/n(1)直接多肽结合试验改良分析/n(1.1)样品制备：建立对照组和复杂受试物组，其中对照组包括半胱氨酸多肽母液750μL、乙腈200μL和复杂受试物溶解溶剂50μL，复杂受试物组包括磷酸缓冲液与半胱氨酸多肽母液750μL、乙腈200μL和一系列不同浓度的复杂受试物50μL，其中半胱氨酸多肽母液的浓度为0.35-0.5mg/mL；/n(1.2)样品孵育：将对照组和复杂受试物组置于25±2.5℃暗处孵育24±2小时备用；/n(1.3)样品检测：将步骤(1.2)中孵育后的样品，采用液相色谱仪分析；/n(1.4)结果分析：计算样品的多肽消耗百分率，并用以进行致敏等级判断；/n(1.5)致敏性预测模型：0％≤多肽消耗百分率≤13.89％，所述复杂受试物为非致敏物，多肽消耗百分率＞13.89％，所述复杂受试物为致敏物；/n(2)人细胞系活化试验分析/n(2.1)细胞铺板：选取THP-1细胞，预处理后待用；/n(2.2)复杂受试物暴露：选取复杂受试物，按比例稀释后获得一系列浓度，加入步骤(2.1)中的THP-1细胞中，培育后待用；/n(2.3)阻断：在步骤(2.2)培育后的细胞中加入FcR阻断剂进行阻断；/n(2.4)CD86/CD54表达检测：在步骤(2.3)阻断后细胞中加入FITC-CD86抗体、PE-CD54抗体、FITC标记的小鼠同型对照IgG1和PE标记的小鼠同型对照IgG1，形成受试物处理组和受试物处理组同型对照，培育后采用流式细胞仪检测蛋白标志物；/n(2.5)数据处理：利用流式细胞仪检测相对荧光强度值RFI；/n(2.6)预测模型：在细胞活率大于50％前提下，对于FITC-CD86，若RFICD86≥150，所述复杂受试物为致敏物；对于PE-CD54，若RFICD54≥200，所述复杂受试物为致敏物，即当RFICD86≥150和/或RFICD54≥200时，所述复杂受试物为致敏物，其余情况则为非致敏物；/n(3)结果预测/n当步骤(1)中直接多肽结合试验改良分析和步骤(2)中人细胞系活化试验分析结果均为致敏性时，所述复杂受试物预测结果为致敏性，当步骤(1)中直接多肽结合试验改良分析和步骤(2)中人细胞系活化试验分析结果均为非致敏性时，所述复杂受试物预测结果为非致敏性。/n...

【技术特征摘要】
1.一种复杂受试物对皮肤致敏性的预测方法，其特征是包括以下步骤：
(1)直接多肽结合试验改良分析
(1.1)样品制备：建立对照组和复杂受试物组，其中对照组包括半胱氨酸多肽母液750μL、乙腈200μL和复杂受试物溶解溶剂50μL，复杂受试物组包括磷酸缓冲液与半胱氨酸多肽母液750μL、乙腈200μL和一系列不同浓度的复杂受试物50μL，其中半胱氨酸多肽母液的浓度为0.35-0.5mg/mL；
(1.2)样品孵育：将对照组和复杂受试物组置于25±2.5℃暗处孵育24±2小时备用；
(1.3)样品检测：将步骤(1.2)中孵育后的样品，采用液相色谱仪分析；
(1.4)结果分析：计算样品的多肽消耗百分率，并用以进行致敏等级判断；
(1.5)致敏性预测模型：0％≤多肽消耗百分率≤13.89％，所述复杂受试物为非致敏物，多肽消耗百分率＞13.89％，所述复杂受试物为致敏物；
(2)人细胞系活化试验分析
(2.1)细胞铺板：选取THP-1细胞，预处理后待用；
(2.2)复杂受试物暴露：选取复杂受试物，按比例稀释后获得一系列浓度，加入步骤(2.1)中的THP-1细胞中，培育后待用；
(2.3)阻断：在步骤(2.2)培育后的细胞中加入FcR阻断剂进行阻断；
(2.4)CD86/CD54表达检测：在步骤(2.3)阻断后细胞中加入FITC-CD86抗体、PE-CD54抗体、FITC标记的小鼠同型对照IgG1和PE标记的小鼠同型对照IgG1，形成受试物处理组和受试物处理组同型对照，培育后采用流式细胞仪检测蛋白标志物；
(2.5)数据处理：利用流式细胞仪检测相对荧光强度值RFI；
(2.6)预测模型：在细胞活率大于50％前提下，对于FITC-CD86，若RFICD86≥150，所述复杂受试物为致敏物；对于PE-CD54，若RFICD54≥200，所述复杂受试物为致敏物，即当RFICD86≥150和/或RFICD54≥200时，所述复杂受试物为致敏物，其余情况则为非致敏物；
(3)结果预测
当步骤(1)中直接多肽结合试验改良分析和步骤(2)中人细胞系活化试验分析结果均为致敏性时，所述复杂受试物预测结果为致敏性，当步骤(1)中直接多肽结合试验改良分析和步骤(2)中人细胞系活化试验分析结果均为非致敏性时，所述复杂受试物预测结果为非致敏性。


2.根据权利要求1所述的复杂受试物对皮肤致敏性的预测方法，其特征是：步骤(1.1)中所述复杂受试物为非单一组分体系，包括非单一组分化学品、化妆品原料、化妆品产品、石油润滑剂、植物提取物、家用洗涤产品、皮肤科药品、生物活性原料、灰尘颗粒、空气污染物纺织品和纺织品浸提液。


3.根据权利要求1所述的复杂受试物对皮肤致敏性的预测方法，其特征是：步骤(1.1)中所述复杂受试物溶解溶剂为乙腈、水、异丙醇、丙酮和二甲亚砜中的一种或几种；步骤(1.1)中一系列不同浓度的复杂受试物的浓度为1000mg/mL、500mg/mL、250mg/mL、100mg/mL和10mg/mL；步骤(1.1)中所述半胱氨酸多肽母液是将半胱氨酸多肽采用磷酸缓冲溶液或体积比为4：1的磷酸缓冲溶液与乙腈的混合液配制而成。

【专利技术属性】
技术研发人员：马莎莎，杜娟，冯鉴鸿，
申请(专利权)人：广州市华代生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44