一种三疣梭子蟹耐副溶血弧菌的分子标记C7及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种三疣梭子蟹耐副溶血弧菌的分子标记C7及其应用。所述分子标记C7的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，用于检测该分子标记C7的引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。所述的分子标记C7为SNP标记，其副溶血弧菌耐受基因型为TT基因型。本发明专利技术提供的分子标记C7可以用于加快三疣梭子蟹耐副溶血弧菌优良性状选育的速度，促进三疣梭子蟹良种培育进程，且不受生长阶段的限制，有利于三疣梭子蟹的健康养殖及可持续发展，因此具有广阔的应用前景。

Molecular marker C7 of Vibrio parahaemolyticus resistant to Portunus trituberculatus and its application

【技术实现步骤摘要】
一种三疣梭子蟹耐副溶血弧菌的分子标记C7及其应用
本专利技术属于DNA分子标记
，具体涉及一种三疣梭子蟹耐副溶血弧菌的分子标记C7及其应用。
技术介绍
三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)属甲壳纲、十足目、梭子蟹科、梭子蟹属，俗称梭子蟹，是我国重要的大型海洋经济蟹类。梭子蟹肉质鲜美、营养丰富，在国内外享有盛名，深受消费者喜爱。副溶血性弧菌是一种海洋细菌，主要来源于鱼、虾、蟹、贝类和海藻等海产品，该菌存活能力强，在海水中可存活47天。若人类食用了含有副溶血性弧菌的海产品，会引起急性疾病、腹痛、呕吐、腹泻等症状。耐副溶血弧菌性状是三疣梭子蟹重要的选育性状之一，对于提高梭子蟹的成活率以及预防食物中毒具有重要意义。然而副溶血弧菌具有耐受性广，繁殖周期快的特点，如果通过传统的育种方法进行选育，则进展过于缓慢，因此急需借助分子标记辅助育种技术来加快选育进程。分子标记是以个体间遗传物质核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。分子标记具有显著的优越性：大多数分子标记为共显性，对隐性性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；生物发育不同阶段、不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记检测手段简单、迅速。目前，有关三疣梭子蟹耐副溶血弧菌的分子标记还未见报道，因此，开发耐副溶血弧菌的分子标记对三疣梭子蟹的健康养殖及育种具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术提供了一种三疣梭子蟹耐副溶血弧菌的分子标记C7及其应用，本专利技术利用测序数据的多态性位点过滤及比对分析、PCR测序的方法，得到SNP和InDel标记，再经过对标记进行逐步的筛选和验证，最终获得一个新的三疣梭子蟹耐副溶血弧菌的分子标记C7，有利于三疣梭子蟹耐受副溶血弧菌性状的筛选和选育。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：本专利技术提供了一种三疣梭子蟹耐副溶血弧菌的分子标记C7，所述分子标记C3的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。进一步的，所述分子标记C7为SNP标记。进一步的，所述分子标记C7的副溶血弧菌耐受基因型为TT基因型。本专利技术还提供了用于检测权利要求1所述的分子标记C7的引物对，其特征在于，所述引物中的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo.2，反向引物的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示。本专利技术还提供了所述的分子标记C7在筛选三疣梭子蟹耐受副溶血弧菌性状品种中的应用。本专利技术还提供了所述的分子标记C7在三疣梭子蟹遗传多样性分析、种质鉴定和遗传图谱构建中的应用。本专利技术与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：1、本专利技术提供的三疣梭子蟹耐副溶血弧菌的分子标记C7可以不受三疣梭子蟹生长阶段的限制，能够用于三疣梭子蟹早期蟹苗选育，进而明显促进三疣梭子蟹的选育进程，加快选育优良性状的速度。2、利用本专利技术提供的分子标记C7检测三疣梭子蟹耐副溶血弧菌的性状，方法准确可靠、操作简单，能够有效、快速的筛选出符合要求的性状，辅助早期育种，实现短时间、低成本的选育出耐副溶血弧菌的三疣梭子蟹的品种，增加优良品质的三疣梭子蟹数量，减少感染几率，提高产量，促进三疣梭子蟹的健康繁殖，进而还可以减少食用海产品的中毒反应，对三疣梭子蟹的健康养殖与发展具有重要的意义，因此具有广阔的应用前景。附图说明图1为本专利技术中混合模板PCR产物的凝胶电泳条带结果。图2为本专利技术中敏感群体混合模板和耐感群体混合模板两组对应位置差异结果，其中1为敏感群体混合模板，2为耐感群体混合模板。图3为本专利技术以筛选的敏感群体混合模板和耐感群体混合模板两组对应位置差异明显的引物进行PCR扩增后产物的凝胶电泳条带结果。图4为本专利技术中C7分子标记部分测序结果，其中1为TT基因型，2为AA基因型，3为TA基因型。具体实施方式以下结合具体实施例对本专利技术的技术方案做进一步详细的说明。本专利技术所用的三疣梭子蟹均来自中国水产科学研究院黄海水产研究所昌邑海丰水产有限公司实验基地，通过拖网捕捞的方法随机从池塘中获得健康活泼的三疣梭子蟹，短暂安置于网筐之中并铺上一层水草以防止螃蟹斗殴，最后获得体重35±3g的三疣梭子蟹300只，放置于4个养殖池(500cm×300cm×150cm)中暂养7d，暂养期间水温保持在22±1℃，加水至20cm，盐度33，pH8.2±0.5，持续供氧，每天早上8点更换新鲜海水，下午5点投喂新鲜杂鱼，喂食量约为螃蟹总重量的1/3。7d后挑选活力、形态较好的梭子蟹进行后续实验。正式实验时把活力旺、体表完好的螃蟹放置于4个水泥池中，每池50只螃蟹，此时水体ph为7.9±0.5，水温保持在22±1℃，水深20cm。然后于梭子蟹游泳足的第一基节膜处注射100μl的副溶血弧菌(浓度为2.26×107cfu/ml)。每天下午5点投喂新鲜杂鱼，喂食量约为螃蟹重量的1/4，保证池底无大量饵料残留影响水质。前48h每隔3h记录一下螃蟹的死亡时间和数量，48h后，对幸存的梭子蟹再次注射100μl的副溶血弧菌(浓度为5.3×107cfu/ml)；此时水体的ph为8.0±0.5，水温保持在22±1℃；继续每隔3h记录一次死亡时间和数量，直至4个池中幸存螃蟹数量为20只时停止实验。最先死亡的20个螃蟹个体为副溶血弧菌感染敏感组，最后存活的20个螃蟹个体为副溶血弧菌感染耐受组，解剖螃蟹取肌肉组织于冻存管中，放于液氮保存。实施例1一、耐副溶血弧菌性状相关候选分子标记筛选1、测序数据过滤和比对采用全式金公司的试剂盒进行DNA的提取，利用硅胶膜离心柱特异吸附DNA原理进行DNA提取。首先，将大约30mg的组织样品放到1.5ml的无菌酶离心管，加入200μlLysisBuffer8(LB8)和20μlRNaseA(10mg/ml)，振荡10s左右的时间，室温条件下孵育2min，加入20μlProteinaseK(20mg/ml)，充分振荡混匀，55℃孵育至完全裂解，加入1.5倍体积的BindingBuffer8(BB8)，混匀后加入离心柱中，在高速低温冷冻离心机(型号为Eppendorf5804R)中12000rpm离心30s，弃废液。然后加入500μl的CleanBuffer8(CB8)，12000rpm离心30s，弃废液(重复一次)，再加入500μl的WashBuffer8(WB8)，12000rpm离心30s，弃废液(重复一次)，12000rpm空离2min，以彻底除去残留的WB8。将离心柱置于一干净的离心管中，在柱的中心加入50微升ElutionBuffer(EB)，室温静置2min，12000rpm离心1min，洗脱DNA。通过琼脂糖凝胶电泳分析DNA的纯度和完整性；利用Nanodrop检测DNA的纯度(OD260/280比值)，利用Qubit对DNA浓度进行精确定量。将检验合格的DNA样品等量混合为两个混合池，分别命名为副溶血弧菌敏感DNA混合池(CG)和耐副溶血弧菌DNA混本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种三疣梭子蟹耐副溶血弧菌的分子标记C7，其特征在于，所述分子标记C3的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种三疣梭子蟹耐副溶血弧菌的分子标记C7，其特征在于，所述分子标记C3的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。


2.根据权利要求1所述的三疣梭子蟹耐副溶血弧菌的分子标记C7，其特征在于，所述分子标记C7为SNP标记。


3.根据权利要求1或2所述的三疣梭子蟹耐副溶血弧菌的分子标记C7，其特征在于，所述分子标记C7的副溶血弧菌耐受基因型为TT基因型。

【专利技术属性】
技术研发人员：吕建建，阎德平，金玲，刘萍，李健，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37