一种检测黄牛NCSTN基因拷贝数变异的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种检测黄牛NCSTN基因拷贝数变异的方法及其应用：基于实时定量PCR，以云岭牛基因组DNA为模板，利用一对特异性PCR引物扩增牛NCSTN基因的拷贝数变异区域部分片段，同时利用另外一对特异性PCR引物扩增牛BTF3基因部分片段作为内参对照，最后利用‑ΔΔCt计算并判定个体的拷贝数变异类型。本发明专利技术提供的方法为建立云岭牛NCSTN基因拷贝数变异与生长性状之间的关联奠定了基础，有利于加快黄牛分子标记辅助选择育种工作，该方法简单、快速，便于推广应用。

A method for detecting copy number variation of NCSTN gene in cattle and its application

【技术实现步骤摘要】
一种检测黄牛NCSTN基因拷贝数变异的方法及其应用
本专利技术属于分子遗传学领域，具体涉及一种检测黄牛(例如，云岭牛)NCSTN基因拷贝数变异的方法，该方法利用基因组DNA为模板进行实时定量PCR，以BTF3基因为参照，根据-ΔΔCt值从而确定个体NCSTN基因的拷贝数变异类型。
技术介绍
拷贝数变异(CopyNumberVariations,CNVs)指的是一个物种两个个体之间的大于50bp的基因组序列的插入、缺失变异，属于基因组结构变异。CNVs可以通过剂量效应、位置效应、阻断功能基因、融合基因、暴露隐性等位基因和潜在的跃迁效应来影响基因的功能以及个体的表型。随着牛全基因组测序工作的完成，牛基因组CNVs研究也成为热点。研究表明，有些CNV位点位于功能基因内部，有些与牛的各种经济性状相关。这些研究说明CNVs与牛的正常生长发育息息相关。在检测已知CNV的各种方法中，实时定量PCR(quantitiveReal-TimePCR,qPCR)是使用比较广泛的一种技术，其操作简单、敏感性高、速度快，PCR中选取单拷贝的基因作为内参基因(如Liu等验证发现的牛单拷贝基因BTF3)，然后利用2-ΔΔCt的方法判定个体的拷贝数变异类型以及相对拷贝数。但目前为止，尚未见到关于检测云岭牛呆蛋白(Nicastrin)基因拷贝数变异的实时定量PCR(quantitiveReal-TimePCR,qPCR)的方法报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测黄牛NCSTN基因拷贝数变异的方法及其应用，以快速建立遗传资源优良的黄牛(例如，云岭牛)种群，加快黄牛良种选育速度。为达到上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：一种检测黄牛NCSTN基因拷贝数变异的方法，包括以下步骤：以待测云岭牛个体全基因组DNA为模板，以引物对P1以及P2为引物，分别通过实时定量PCR扩增NCSTN基因的拷贝数变异区域以及作为内参对照的BTF3基因的部分片段，然后根据定量结果鉴定云岭牛个体NCSTN基因的拷贝数变异类型。优选的，所述的NCSTN基因的拷贝数变异区域位于牛NCSTN基因参考基因组序列NC_037330.1的9345960位至9349559位。优选的，所述的拷贝数变异类型是根据-ΔΔCt将定量结果分为的三类：多拷贝型，-ΔΔCt>0.5；缺失型，-ΔΔCt<-0.5；正常型，-0.5≤-ΔΔCt≤0.5。优选的，所述的引物对P1为：上游引物F1：5’-ACCTACTACCCTCATCGCCT-3’下游引物R1：5’-CTGTGTTCGTGGCTGTTGAC-3’；所述的引物对P2为：上游引物F2：5’-AACCAGGAGAAACTCGCCAA-3’下游引物R2：5’-TTCGGTGAAATGCCCTCTCG-3’。优选的，所述的实时定量PCR所用的扩增体系以12.5μL计包括：50ng/μL模板DNA1μL、10μmol/L的引物对P1或P2所对应的上、下游引物各0.5μL、纯水4.25μL，及PremixExTaqTMII6.25μL。优选的，所述的实时定量PCR所用的反应程序为：(1)95℃预变性1min；(2)95℃变性10s，60℃退火30s，共40个循环。上述检测黄牛NCSTN基因拷贝数变异的方法在黄牛分子标记辅助选择育种中的应用。优选的，所述拷贝数变异类型中，具有多拷贝型拷贝数变异类型的个体(例如，云岭牛个体)在生长性状上显著优于具有正常型、缺失型拷贝数变异类型的个体。优选的，所述生长性状选自胸围、管围中的一种或两种。一种与黄牛生长性状相关的NCSTN基因拷贝数变异的实时定量PCR检测试剂盒，该试剂盒包括上述引物对P1和P2。本专利技术的有益效果体现在：本专利技术公开的检测黄牛NCSTN基因拷贝数变异的方法，与高通量测序方法、基因芯片等方法相比，快速、简单、成本低，能够准确的鉴定个体的拷贝数变异类型。根据本专利技术对黄牛(例如，云岭牛)NCSTN基因的CNV变异类型进行的检测和类型频率统计，以及该CNV与黄牛(例如，云岭牛)的生长性状进行的关联分析，结果表明该CNV中的特定类型可以作为黄牛生长性状早期选择的分子标记，用于黄牛的快速选育。附图说明图1为本专利技术中进行qPCR(NCSTN基因)绘制的熔解曲线。具体实施方式下面结合附图和实施例对专利技术做详细说明，所述实施例是对本专利技术的解释而不是对本专利技术保护范围的限制。在前期的黄牛基因组重测序研究当中，发现牛NCSTN基因组序列(参考基因组序列NC_037330.1)的9345960位至9349559位发生了拷贝数变异(CNV)，但基于NCSTN基因的生理作用，尚无法明确其CNV在黄牛重要经济性状中的调节机制。本专利技术根据以上重测序得到的牛NCSTN基因组序列中发生拷贝数变异的区域设计特异性引物，然后以云岭牛基因组DNA为模板，进行qPCR扩增，并以BTF3基因为内参基因，利用2-ΔΔCt方法，判定个体的拷贝数类型。本专利技术通过利用qPCR技术，检测云岭牛NCSTN基因的拷贝数变异情况，并将不同的拷贝数变异类型与个体生长性状进行关联分析，发现了具有优势生长性状的拷贝数变异类型，从而可以加快云岭牛的种质资源改良工作，为黄牛的分子育种工作提供基础资料。1.样品的采集及基因组DNA提取(1)血样的采集本专利技术中采集的云岭牛来自于云南省昆明市小哨乡草地动物科学研究院，于2018年8月采集，均为24月龄，共计119个个体，血液的采集方法为颈静脉采血。同时收集这些个体的生长性状数据记录，如体高、体长、胸围、管围、尻长、坐骨端宽、十字部高等，以用于后续的关联分析。(2)血样DNA的提取①冷冻血样(主要为血细胞)室温解冻，吸取500μL血液于1.5mL离心管中，加入等体积的磷酸缓冲液(PBS)混匀，温和摇动，4℃、12000r/min离心5min，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明。②在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，轻轻吹打，使血细胞沉淀脱离离心管壁，37℃水浴1h。③加蛋白酶K5μL(20mg/mL)，并混匀，55℃水浴中消化过夜(16h左右)至絮状沉淀不见，溶液澄清，尚未澄清的，可补加10μL蛋白酶K混匀继续消化直至澄清。④将反应液冷却至室温，加入500μLTris饱和酚，温和摇动15min，使其充分混匀，4℃、12000r/min离心10min，将上层水相转入另一灭菌离心管；重复步骤1次。⑤加入氯仿500mL，温和摇动20min，使其充分混匀，4℃、12000r/min离心15min，将上层水相转入另一灭菌的1.5mL离心管。⑥加入氯仿、异戊醇混合液(24:1)500mL，充分混合20min，4℃、12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中。⑦加入0.1倍体积的NaAc缓冲液及2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测黄牛NCSTN基因拷贝数变异的方法，其特征在于：包括以下步骤：/n以云岭牛基因组DNA为模板，分别通过实时定量PCR扩增NCSTN基因的拷贝数变异区域以及作为内参对照的BTF3基因的部分片段，然后根据定量结果鉴定云岭牛NCSTN基因的拷贝数变异类型。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测黄牛NCSTN基因拷贝数变异的方法，其特征在于：包括以下步骤：
以云岭牛基因组DNA为模板，分别通过实时定量PCR扩增NCSTN基因的拷贝数变异区域以及作为内参对照的BTF3基因的部分片段，然后根据定量结果鉴定云岭牛NCSTN基因的拷贝数变异类型。


2.如权利要求1所述一种检测黄牛NCSTN基因拷贝数变异的方法，其特征在于：所述的NCSTN基因的拷贝数变异区域位于牛NCSTN基因参考基因组序列NC_037330.1的9345960位至9349559位。


3.如权利要求1所述一种检测黄牛NCSTN基因拷贝数变异的方法，其特征在于：所述的拷贝数变异类型是根据-ΔΔCt将定量结果分为的三类：多拷贝型，-ΔΔCt>0.5；缺失型，-ΔΔCt<-0.5；正常型，-0.5≤-ΔΔCt≤0.5。


4.如权利要求1所述一种检测黄牛NCSTN基因拷贝数变异的方法，其特征在于：所述的NCSTN基因的拷贝数变异区域部分片段的扩增引物对为：
上游引物F1：5’-ACCTACTACCCTCATCGCCT-3’
下游引物R1：5’-CTGTGTTCGTGGCTGTTGAC-3’；
所述的BTF3基因的部分片段的扩增引物对为：
上游引物F2：5’-AACCAGGAGAAACTCGCCAA-3’
下游引物R2：5’-TTCGGTGAAATGCCCTCTCG-3’。


5.如权利要求1所述一种检测黄牛NCSTN基因拷贝数变异的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄永震，姚宇飞，徐嘉威，张子敬，吕世杰，蔡翠翠，贺花，安清明，王大会，王献伟，黄必志，雷初朝，陈宏，胡沈荣，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61