一种酶法检测甘氨酸含量的方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种酶法检测甘氨酸含量的方法及其应用，利用甘氨酸氧化酶Glycine Oxidase以及乙醛酸还原酶Glyoxylate Reductase的双酶偶联体系，测定甘氨酸的含量；本发明专利技术的酶法检测甘氨酸含量的方法克服了传统甘氨酸氧化酶偶联辣根过氧化物酶HRP方法不适用于血液环境的缺陷，创造性地通过甘氨酸氧化酶Glycine Oxidase以及乙醛酸还原酶Glyoxylate Reductase双酶偶联的方法，将甘氨酸氧化形成乙醛酸，又通过乙醛酸的还原反应，以NADH含量的减少来快速正确表征体系中的甘氨酸含量；本发明专利技术灵敏度高，检测迅速稳定，重复性好，操作简便，成本较低，适用范围较广。

An enzymatic method for the determination of glycine and its application

【技术实现步骤摘要】
一种酶法检测甘氨酸含量的方法及其应用
本专利技术涉及酶法检测
，具体说是一种酶法检测甘氨酸含量的方法及其应用。
技术介绍
目前检测甘氨酸的方法主要有液相色谱法、离子色谱法、分光光度法等。液相色谱法和离子色谱法分析灵敏度高，分离效果好，适合复杂样品的分析测定，但是液相色谱测定甘氨酸的方法中需要对样品进行柱前衍生处理，且两者仪器费用昂贵，耗时成本高，不适用于高通量样品的分析测定。传统分光光度法来测定甘氨酸含量的检测体系主要基于甘氨酸氧化酶GlycineOxidase与辣根过氧化物酶HRP的偶联反应，通过产物过氧化氢-苯酚-4-氨基安替比林或者产物过氧化氢与OxiRedProbe的显色体系来测定甘氨酸的浓度，这两种方法具有操作简单，检测迅速的优点。但是该方法在用于检测血液样品时，HRP的酶活受到血液环境的抑制，反应无法正常进行，不能得到样品中甘氨酸含量的准确结果。这限制了甘氨酸氧化酶-辣根过氧化物酶及其试剂盒在上述样品中的应用。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中存在的不足，提供了一种酶法检测甘氨酸含量的方法及其本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种酶法检测甘氨酸含量的方法，其特征在于，步骤如下：利用甘氨酸氧化酶Glycine Oxidase以及乙醛酸还原酶Glyoxylate Reductase的双酶偶联体系，测定甘氨酸的含量。/n

【技术特征摘要】
1.一种酶法检测甘氨酸含量的方法，其特征在于，步骤如下：利用甘氨酸氧化酶GlycineOxidase以及乙醛酸还原酶GlyoxylateReductase的双酶偶联体系，测定甘氨酸的含量。


2.根据权利要求1所述的一种酶法检测甘氨酸含量的方法，其特征在于，步骤如下：
（1）蛋白的外源表达及分离纯化
1）制备甘氨酸氧化酶GlycineOxidase目的基因和乙醛酸还原酶GlyoxylateReductase目的基因；
2）将步骤1）所得的甘氨酸氧化酶GlycineOxidase目的基因和乙醛酸还原酶GlyoxylateReductase目的基因分别连入pET28a表达载体，得到pET28a-GO与pET28a-GR质粒；
3）将pET28a-GO与pET28a-GR质粒分别转入大肠杆菌Rosetta菌株中后在培养基中进行培养，得到甘氨酸氧化酶GlycineOxidase目的基因和乙醛酸还原酶GlyoxylateReductase目的蛋白；
4)分离纯化目的蛋白；
（2）利用分离纯化得到的目的蛋白，通过双酶偶联法对样品中的甘氨酸的含量进行检测。


3.根据权利要求2所述的一种酶法检测甘氨酸含量的方法，其特征在于，所述步骤4）中分离纯化目的蛋白的步骤为：
A、将步骤3）得到的含有甘氨酸氧化酶GlycineOxidase目的基因和乙醛酸还原酶GlyoxylateReductase目的蛋白的菌液低温离心，去除上清液，收集菌体，加入缓冲液A，并将菌体悬浮于缓冲液A中；
B、破碎菌体后，离心，收集上清液；
C、上清液过镍柱，用洗脱液进行洗脱；
D、将洗脱得到的酶液置于超滤管中进行离心、浓缩，浓缩后的蛋白溶液分装，即可得到分离纯化目的蛋白。


4.根据权利要求3所述的一种酶法检测甘氨酸含量的方法，其特征在于：所述步骤A中，离心的反应温度为4~16℃，转速为10000~12000rpm；所述步骤D中，离心的反应温度为4~16℃，转速为5000~6000rpm。


5.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱虹，花强，董辉，金维荣，邓伟伟，
申请(专利权)人：申友基因组研究院南京有限公司，上海强灏生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32