一种用于捕获循环肿瘤细胞的双层微流控芯片制造技术

本发明专利技术公开了一种用于捕获循环肿瘤细胞的双层微流控芯片，属于微流控技术领域。本发明专利技术的双层微流控芯片，包括上下对应设置且相互连通的上层芯片和下层芯片，上层芯片和下层芯片内均设有微柱阵列以实现对肿瘤细胞的多次捕获；且下层芯片内还设有碗形结构以聚集肿瘤细胞，当利用激光检测富集CTCs的特征光谱时信号增强，可以获得该肿瘤病人的肿瘤类型及基因蛋白质光谱特征。本发明专利技术的双层微流控芯片，克服了现有技术中肿瘤细胞捕获率不高的不足，其结构设计巧妙，可以根据需求对循环肿瘤细胞的捕获方法进行结合选用，提高了CTCs的捕获率，避免个别肿瘤细胞被遗漏。

A double-layer microfluidic chip for capturing circulating tumor cells

【技术实现步骤摘要】
一种用于捕获循环肿瘤细胞的双层微流控芯片
本专利技术属于微流控
，更具体地说，涉及一种用于捕获循环肿瘤细胞的双层微流控芯片。
技术介绍
癌症是威胁人类健康的第一大疾病。2018年全球新增1810万癌症病例，死亡人数达960万，全球癌症负担进一步加重。在全球癌症发病率中排在前三是肺癌、乳腺癌和结肠癌，同时它们分别在各类癌症死亡率排行榜上排第一、第五和第二。综合看来，这三类癌症发病率和死亡率占据了全球癌症的1/3。90％的癌症病人死于癌转移，攻克癌症是人类孜孜以求不停追求的目标。传统的切除、化疗、放射线治疗等方法成本高，给病人带来较大痛苦且具有复发性。循环肿瘤细胞(CTCs)是从原生瘤或再生瘤脱落，进入血液循环系统或淋巴系统中的肿瘤细胞。这些肿瘤细胞定植远端组织，最终形成癌症转移，导致病人死亡。然而，对循环肿瘤细胞的分离及后续分子生物学、基因分析等对肿瘤的检测诊断、肿瘤的进展转移研究和疗效评价具有重要意义。血液循环系统CTCs的数目是极其稀少的，癌症病人血液中分离循环肿瘤细胞具有高技术的难度。CTCs的数目与癌症的严重程度有着密切的联系。数目多，病情严重，数目少病情轻或治疗有效。微流控芯片的微通道与细胞的尺寸相当，是一种体积小、成本低、试剂消耗低、便携性好的新技术，被称为“液体活检”。现有的利用微流控芯片研究CTCs的捕获分离方法大体可分为三类：一类利用亲和性(Affinity-based)原理进行细胞的捕获与分离，该方法基于在微流控芯片内部的微通道或微结构上修饰能够与肿瘤细胞表面抗原结合的特异性抗体如anti-EpCAM如CTC-chip，或者适配体。Herringbone-chip(HB-Chip)的微漩产生的鱼鳞形芯片改变微柱阵列(CTC-Chip设计78,000圆柱形微柱)为鱼鳞形，提高了细胞与抗体修饰的微结构碰撞几率，提高了捕获效率与纯度。但这种微流控芯片的结构通常非常复杂，修饰时间长，抗体昂贵且依赖于EpCAM的不同表达。当肿瘤细胞发生上皮间质转化(EMT)时，肿瘤细胞的EpCAM的表达降低。因此依赖于该方法捕获CTCs有可能会失去一部分不表达或低表达EpCAM的肿瘤细胞。该捕获方法依赖于细胞与抗体修饰的柱子的碰撞几率，加速流速时，细胞与抗体修饰柱子的碰撞几率降低且相互作用的时间减少，捕获率下降。典型的基于亲和性微流控芯片结构有CTC-chip、HB-Chip、氧化石墨烯芯片(agrapheneoxidechip)、HTMSU、Onco-BeanChip和aGO-polymerdevice。另一类是基于物理特性比如尺寸形变(ISET：isolationbysizeofepithelialtumorcells)进行捕获，利用CTCs比血细胞大且不易形变的特征，滤过血细胞。该方法操作简单，结构勿需过于复杂、不需修饰且不依赖于任何表面的标志物。但由于CTCs与白细胞的尺寸有重叠的部分，所以一部分CTCs可能会通过滤网或微柱间隙导致损失一部分和白细胞尺寸有重叠部分的CTCs，尤其是那些尺寸较小的CTCs。因为经历了EMT的转变，所以漏掉的CTCs恶性程度更高，且容易破裂、纯度不高，容易发生堵塞。但与亲和性或其他如双向电泳等方法相比较，该方法简易切实可行，更适于临床应用如利用惯性分离的圆形螺旋形芯片、CTC聚合芯片、MOA过滤器和微流棘齿。第三类是磁性捕获，将肿瘤细胞修饰上EpCAM抗体修饰的微磁珠，通过混合摇晃将靶细胞(肿瘤细胞)包被上微磁珠。这样肿瘤细胞就被包被上磁珠，尺寸放大并且具有磁性。捕获时在微流控的下方放置一块磁性很强的肿瘤细胞，连接上磁珠具有“磁性”的肿瘤细胞被磁铁的强磁性吸引在微流控芯片的下方被捕获，没有磁性的血细胞流走。例如免磁检测腔室、“Ephesia”、CTCs磁性捕获的量子点与磁珠，微磁与微流相结合的芯片μ-MACS+GASI。另外，也有将红细胞裂解后，白细胞“孵育”上磁珠，利用磁性去除白细胞，再利用尺寸捕获住肿瘤细胞。精巧地设计微流控芯片可以实现微流控CTCs的应用。微流控CTCs应满足以下几点要求：(1)高捕获率：1ml的血液中仅有1-10个肿瘤细胞却有107个白细胞和109个红细胞，所以高捕获率的检测到血样中的每一个肿瘤细胞具有至关重要的意义；(2)高纯度：分离的CTCs没有掺杂其他的细胞如白细胞与红细胞等血细胞，更利于检测如光学检测、识别与计数；(3)高通量：高效快速地分离出肿瘤细胞以满足临床的需求；(4)保持细胞的活性：捕获后肿瘤细胞的富集、活性，以便于分子生物学基因分析，从而确定病人的病情与治疗方案。目前唯一应用于临床的只有捕获率不高的得到美国FDA认证的CellSearch，仅局限于乳腺癌，结直肠癌和前列腺癌，但仍存在效率低、半自动化的缺陷。专利技术人此前基于微流控技术设计一种肿瘤细胞捕获微流控芯片，申请日为2016年1月22日，专利申请号为2016100441060，该方案中的微流控芯片包括基材、以及形成于所述基材内的微通道，该微通道沿平滑曲线方向延伸，其两端分别形成有入口和出口，所述微通道内沿竖直方向凸伸有微柱阵列，该微柱阵列沿所述微通道的延伸方向阵列分布，其位于入口处的一端贴合于所述微通道的一侧壁，其位于出口处的一端贴合于所述微通道的另一侧壁，所述微柱阵列的中部等间距阵列分布有三角形横截面的捕获腔体，该捕获腔体的三个顶角分别形成三个5微米的间隙，用于一个肿瘤细胞的2-3次捕获。该方案中的芯片结合了2种捕获方法，实用于表达EpCAM与不表达EpCAM的CTCs，不表达和低表达EpCAM的CTCs及未连接上磁珠的CTCs可利用5微米间距的微柱阵列进行捕获，但是该方案对于循环肿瘤细胞的捕获率并不高，有待进一步提高和改进。再如专利申请号：2015102305988，申请日：2015年5月8日，专利技术创造名称为：一种用于肿瘤细胞分选的双层微流控芯片，其包括第一芯片和位于第一芯片下方的第二芯片，所述第一芯片的表面具有样品通道，与所述样品通道相对的第二芯片的表面具有缓冲液通道，所述样品通道与缓冲液通道交叉相通。相对于CellSearch检测方法，利用该方案中的双层微流控芯片分析肿瘤细胞的技术不需要多步操作，可一步连续完成，操作简单，检测速度更快，富集的CTCs纯度更高。但是由于该方案中的微流控芯片不使用抗体，只是单一地采用物理尺度筛选方法，难以实现对血液内循环肿瘤细胞的精准捕获。因此，针对上述问题，亟需设计一种高精度并且能够实现快速捕获循环肿瘤细胞的微流控芯片，以满足临床上对于血液中循环肿瘤细胞的检测。
技术实现思路
1.专利技术要解决的技术问题本专利技术提供了一种用于捕获循环肿瘤细胞的双层微流控芯片，克服了现有技术中肿瘤细胞捕获率不高的不足，可以根据需求对循环肿瘤细胞的捕获方法进行结合选用，提高了CTCs的捕获率，避免个别肿瘤细胞被遗漏。2.技术方案为达到上述目的，本专利技术提供的技术方案为：本专利技术的一种用于捕获循环肿瘤细胞的双层微流控芯片，包括上下对应设置且相互连通的上层芯片和下层芯片，上层芯片内自圆心沿半径方向向外延伸形成多本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于捕获循环肿瘤细胞的双层微流控芯片，其特征在于：包括上下对应设置且相互连通的上层芯片和下层芯片，所述上层芯片内自圆心沿半径方向向外延伸形成多簇上层通道(100)，所述上层芯片在圆心处设置上层入口(112)、在圆周处设置上层出口(113)，所述上层入口(112)、上层出口(113)分别与上层通道(100)相连通，所述上层通道(100)内设有上层微柱阵列(200)，所述上层微柱阵列(200)形成用于捕获循环肿瘤细胞的微柱通道，所述微柱通道的宽度小于循环肿瘤细胞的直径；/n所述下层芯片自圆周沿半径方向延伸形成下层通道(300)，所述下层芯片在圆周处设置下层入口(310)、在半径处设置下层出口(311)，所述下层入口(310)、所述下层出口(311)分别与下层通道(300)相连通，且所述上层出口(113)与所述下层入口(310)相连通；/n所述下层通道(300)内设有下层微柱阵列(400)，所述下层微柱阵列(400)包括碗形结构(420)，所述碗形结构(420)上设有缺口(421)，相邻的两个碗形结构(420)的缺口(421)形成用于富集循环肿瘤细胞的捕获腔(422)，所述缺口(421)的曲率半径不大于30微米，相邻两个碗形结构(420)形成的碗底通道(423)宽度不大于8微米。/n...

【技术特征摘要】
1.一种用于捕获循环肿瘤细胞的双层微流控芯片，其特征在于：包括上下对应设置且相互连通的上层芯片和下层芯片，所述上层芯片内自圆心沿半径方向向外延伸形成多簇上层通道(100)，所述上层芯片在圆心处设置上层入口(112)、在圆周处设置上层出口(113)，所述上层入口(112)、上层出口(113)分别与上层通道(100)相连通，所述上层通道(100)内设有上层微柱阵列(200)，所述上层微柱阵列(200)形成用于捕获循环肿瘤细胞的微柱通道，所述微柱通道的宽度小于循环肿瘤细胞的直径；
所述下层芯片自圆周沿半径方向延伸形成下层通道(300)，所述下层芯片在圆周处设置下层入口(310)、在半径处设置下层出口(311)，所述下层入口(310)、所述下层出口(311)分别与下层通道(300)相连通，且所述上层出口(113)与所述下层入口(310)相连通；
所述下层通道(300)内设有下层微柱阵列(400)，所述下层微柱阵列(400)包括碗形结构(420)，所述碗形结构(420)上设有缺口(421)，相邻的两个碗形结构(420)的缺口(421)形成用于富集循环肿瘤细胞的捕获腔(422)，所述缺口(421)的曲率半径不大于30微米，相邻两个碗形结构(420)形成的碗底通道(423)宽度不大于8微米。


2.根据权利要求1所述的一种用于捕获循环肿瘤细胞的双层微流控芯片，其特征在于：所述上层微柱阵列(200)位于上层入口(112)的一端与上层通道外侧(111)相贴合，所述上层微柱阵列(200)位于上层出口(113)的一端与上层通道内侧(110)相贴合，所述上层微柱阵列(200)与该上层通道(100)基本平行，血样沿上层通道内侧(110)向上层通道外侧(111)流动并穿过上层微柱阵列(200)。


3.根据权利要求2所述的一种用于捕获循环肿瘤细胞的双层微流控芯片，其特征在于：所述上层微柱阵列(200)包括并列设置的弧形微柱(210)、矩形微柱(211)以及三角形微柱(212)，各微柱沿上层通道(100)延伸方向等间距阵列分布，相邻的矩形微柱(211)沿其相对的侧边形成第一通道(220)，所述矩形微柱(211)的另一侧边与相邻的三角形微柱(212)的侧...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈红梅，刘银年，李庆利，焦晓栋，刘国庆，王双寿，贾虎，任福刚，李勇，
申请(专利权)人：安徽工业大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34