白鲜碱的新应用制造技术

本发明专利技术公开白鲜碱的新应用，白鲜碱能够与c‑Met相互结合，可以在制备c‑Met的抑制剂中进行应用；本发明专利技术通过分子对接的方法计算出白鲜碱呋喃环上的氧原子与MET1160能够形成一个H氢键相互作用，并通过CETSA技术证实白鲜碱能够与c‑Met相互结合，且白鲜碱的浓度越高，其结合能力越强，最佳的结合时间为2‑3小时，进一步通过Western Blot技术证实白鲜碱具有抑制c‑Met表达的作用，即发挥了促进其降解的功能；为c‑Met抑制剂的开发提供了一种新的高效、价廉的化合物。

New application of leucorrhizine

【技术实现步骤摘要】
白鲜碱的新应用
本专利技术属于医药领域，具体涉及白鲜碱在制备c-Met抑制剂中的应用。
技术介绍
c-Met是异二聚体受体酪氨酸激酶(RTKs)亚族的原型成员，并且是肝细胞生长因子(HGF)的受体，RTK失调，异常激活，遗传改变和突变与包括癌症在内的许多疾病的发生以及对抗癌治疗的抗性有关。c-Met与多种癌基因产物和调节蛋白相关，具有很强的促细胞增殖的作用。它参与多种体内过程，在细胞的增殖、代谢以及肿瘤的产生、转移、血管生成中扮演着重要的角色，这使c-Met成为抗肿瘤治疗的重要靶点，并对癌症药物的开发注入新的希望。白鲜碱(dictamnine)是白鲜皮的主要成分之一，又称白鲜胺或白藓碱，属呋喃喹啉类生物碱，在白鲜皮中含量约0.1%。白鲜碱能抑制血小板聚集、松弛血管并降低血压等，具有抗菌、抗病毒和治疗皮肤湿疹和皮肤瘙痒的作用。目前白鲜碱提取工艺较为成熟，市售的白鲜碱一般都较为价廉且质高。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种白鲜碱的新应用，揭示白鲜碱能够与c-Met相互结合，白鲜碱在制备c-Met抑制剂中的应用。本专利技术所述白鲜碱还可以加入一种或多种药物上可接受的辅料，以改善抑制剂吸收效果或便于服用，如制成胶囊或丸剂、粉剂、片剂、粒剂、口服液和注射液等。本专利技术所述辅料包括药学领域常规的填充剂、稀释剂、粘合剂、赋形剂、吸收促进剂、表面活性剂和稳定剂等，必要时还可加入香味剂、色素和甜味剂等。本专利技术所述白鲜碱为常规市售白鲜碱或者常规工艺提取的白鲜碱。本专利技术通过分子对接的方法计算出白鲜碱呋喃环上的氧原子与MET1160能够形成一个H氢键相互作用，并通过CETSA技术证实白鲜碱能够与受体酪氨酸激酶c-Met相互结合，且白鲜碱的浓度越高，其结合能力越强，而最佳的结合时间为2-3小时，而WesternBlot技术则证实白鲜碱具有抑制c-Met表达的作用，即发挥了促进其降解的功能，白鲜碱抑制c-Met的表达，可以阻断肺癌发生发展中与c-Met受体相关的通路，并抑制下游网络信号，从而实现对癌症的控制。本专利技术为c-Met抑制剂的开发提供了一种新的高效、价廉的化合物白鲜碱。附图说明图1为实施例1为白鲜碱与c-Met的分子对接图；图2为实施例2为白鲜碱处理细胞裂解液的CETSA结果图；图3为实施例3为白鲜碱处理活细胞的CETSA结果图；图4为实施例4为不同浓度的白鲜碱处理活细胞的CETSA结果图；图5为实施列5为白鲜碱处理活细胞不同时间的CETSA结果图；图6为实施列6为白鲜碱处理细胞后c-Met磷酸化水平及表达量改变的结果图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明，实施例中涉及到%，均为体积百分数；实施例中用到的磷酸缓冲盐溶液是按照常规方法配制的1×磷酸缓冲盐溶液；蛋白酶抑制剂(通用型，100X，即Proteaseinhibitorcocktailforgeneraluse，100X)是一种通用型用于细胞或组织蛋白提取等的蛋白酶抑制剂混合物(200mMAEBSF，30μMAprotinin，13mMBestatin，1.4mME64and1mMLeupeptininDMSO)，含蛋白酶抑制剂的磷酸缓冲盐溶液是将蛋白酶抑制剂按照体积比1:100加入到磷酸缓冲盐溶液中得到；实施例中所使用的其他试剂均为市场上购得的常规试剂，使用代码均为本领域技术人员公知，如WesternBlot、SDS-PAGE、TBST等。实施例1配体与受体相互作用是分子识别的过程，主要包括静电作用、氢键作用、疏水作用、范德华作用等，分子对接（moleculardocking）是依据配体与受体作用的“锁-钥原理”（lock&keyprinciple），模拟配体小分子与受体生物大分子相互作用的一种技术方法，通过计算，可以预测配体与受体之间的结合模式。通过分子对接的方法计算出白鲜碱呋喃环上的氧原子与MET1160能够形成一个H氢键相互作用，具体步骤如下：（1）蛋白数据来源：A.设置关键词“c-Met”在PDB数据库（http：//www.rcsb.org/pdb/home/home.do）检索构象；B.根据以下条件进行筛选：①通过X晶体衍射法获取的蛋白结构；②蛋白的晶体解析度小于3Å；③分型明确的蛋白；④优先选择已有分子对接的文献报道的蛋白结构；C.最终选定PDB编号为：4IWD；（2）分子对接：A.先使用AutoTools对蛋白进行加氢去除水分子处理；B.使用AutoGrid进行能量格点计算，设置GridBox坐标（-8.833，12.926，-16.482），盒子大小为20×20×20个网格点，每个小网格点的距离为0.1nm；C.使用AutodockVina进行小分子与蛋白对接，取打分最高的构型进行分析作图。如图1所示，为打分最高的构型图，从图中可知，小分子（白鲜碱）进入了蛋白（c-Met）的活性口袋，其中呋喃环上的氧原子与MET1160形成一个H氢键相互作用，此外小分子芳香环上的H分别与PRO1158、MET1160、ILE1084三个氨基酸形成三个弱的Aromatic-H（相比前面那个氢键稍微弱一点的芳香氢键）相互作用，这几个相互作用是促进小分子结合到活性位点的主要作用。实施例2本实施例利用细胞热转变分析（CETSA）技术检测白鲜碱与细胞裂解液中c-Met的结合能力，细胞热转变分析（CETSA）技术可以直接在细胞或组织内检测药物和标靶蛋白的结合亲和力，具体步骤如下：（1）A549肺腺癌细胞的培养及传代：A、A549细胞的培养：A549培养于1640培养基，培养基中含10%胎牛血清，1%青链霉素，培养于37℃、5%CO2环境中；B、A549细胞的传代：待步骤A中细胞密度达到80%时，需进行传代，弃去全部培养基，用预热至37℃的磷酸缓冲盐溶液漂洗三次，加入胰蛋白酶至细胞完全消化后，加入新鲜1640细胞培养液中和胰蛋白酶，并吹打均匀，800rpm离心3分钟，去掉上清液，加入新鲜培养基吹打混匀细胞，按照1:4的比例传代至新的培养瓶中，轻轻摇晃使细胞分布均匀，37℃、5%CO2环境中继续培养；（2）白鲜碱与细胞裂解液中c-Met结合的验证：A、细胞铺板：步骤（1）A549细胞培养至对数生长期，加入胰蛋白酶至细胞完全消化后离心，去上清，用新鲜1640培养基吹打混匀细胞沉淀，制成单细胞悬液，铺于1个T25细胞培养瓶用于CETSA实验，37℃、5%CO2培养24小时，24小时后，用胰蛋白酶将细胞消化下来并离心，用600µL含蛋白酶抑制剂的磷酸缓冲盐溶液重悬细胞沉淀，将细胞重悬液分至两个1.5EP管中，每管300µL；B、反复冻融法裂解细胞：将两管细胞悬液置于-152℃超低温冰箱，30分钟后，取出本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.白鲜碱在制备c-Met抑制剂中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.白鲜碱在制备c-...

【专利技术属性】
技术研发人员：安输，虞姣姣，徐天瑞，郝佩琪，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：云南;53