本发明专利技术涉及丹皮酚在制备沙门氏菌III型分泌系统抑制剂中的应用，以人宫颈癌细胞(HeLa)为感染载体，通过体内外试验证实丹皮酚通过抑制Ⅲ型分泌系统的功能，从而对沙门氏菌感染具有显著的抑制作用。相比传统抗生素在治疗沙门氏菌感染的过程中的作用机制，中药化合物丹皮酚可直接抑制沙门氏菌Ⅲ型分泌系统的功能而发挥抗感染的作用，给予细菌的选择压力小，不易诱导细菌耐药性的产生，具有来源广泛、成本低廉和治愈率高的特点。
Application of Paeonol in the preparation of type \u2162 secretion system inhibitor of Salmonella
【技术实现步骤摘要】
丹皮酚在制备沙门氏菌Ⅲ型分泌系统抑制剂中的应用
本专利技术涉及丹皮酚在制备沙门氏菌三型分泌系统(T3SS)抑制剂中的应用，属于医学制药
技术介绍
1885年沙门氏等人首次分离到猪霍乱沙门氏菌并定名为沙门氏菌属。沙门氏菌为两端钝圆的革兰氏阴性短杆菌，无芽孢，一般无荚膜。该病原菌在自然界有广泛的宿主，对人和动物都致病，这类病原菌感染给畜禽养殖业带来严重的经济损失，尤其严重威胁发展中国家的公共卫生安全和食品安全。据统计，在细菌性食物中毒中由沙门氏菌引起的中毒常常位列首位。除导致食物中毒外，该菌感染动物后常导致严重的疾病，如胃肠炎、伤寒、副伤寒、败血症及其他组织局部炎症，严重时可引起怀孕母畜的流产和死胎等。目前，对抗沙门氏菌感染普遍采用抗生素进行治疗，但临床生产中抗生素的不合理使用导致沙门氏菌的耐药性日益加剧，当前耐药性的产生速度已经远远超过新型抗生素的研发速度，这种现状迫使我们寻求新的抗感染策略来防治沙门氏菌感染。随着对沙门氏菌发病机制的深入研究，发现沙门氏菌的致病力与其毒力岛(SPI)介导编码的两套T3SS密切相关，沙门氏菌通过其分泌的多种效应蛋白(毒力蛋白)介导细菌入侵至宿主细胞、胞内存活和复制及宿主免疫系统中发挥重要作用。因此，以T3SS效应蛋白或蛋白复合物为靶标的药物筛选策略成为新的研究方向。该方案不仅可发挥抗感染作用，而且对细菌选择性压力小，不易诱导产生耐药性。研究表明，Ⅲ型分泌系统广泛的分布于革兰氏阴性细菌中，该策略可能同样适用于抵抗其它类型病原菌的感染。丹皮酚为白色或微黄色有光泽的针状结晶，主要是从毛莨科植物牡丹的根皮或萝藦科植物徐长卿的全草中提取，具有多种药理学活性，如具有镇静、催眠、抗菌、抗炎、抗氧化、降血压等作用。目前，国内外未见丹皮酚通过抑制沙门氏菌Ⅲ型分泌系统的功能来抵抗沙门氏菌感染的报道。
技术实现思路
本专利技术所述丹皮酚CAS登录号为552-41-0，分子式为C9H10O3，分子量为166.17。丹皮酚的化学结构式如下：本研究以沙门氏菌T3SS为靶标建立抑制剂筛选平台，使用β-内酰胺酶-SipA融合报告系统发现天然化合物丹皮酚能够显著阻断鼠伤寒沙门氏菌T3SS效应蛋白SipA向宿主细胞内的转运，进而抑制T3SS的功能。体外研究表明，丹皮酚在有效浓度范围内不影响沙门氏菌的正常生长，表明丹皮酚对沙门氏菌T3SS的抑制作用不是通过抑制细菌的生长而实现；沙门氏菌感染人宫颈癌细胞(HeLa)模型表明，丹皮酚对沙门氏菌介导的HeLa细胞损伤具有显著的保护作用。体内研究表明，丹皮酚对沙门氏菌感染小鼠保护率可达40％，同时经丹皮酚治疗后感染小鼠靶器官(肝脏和脾脏)内沙门氏菌定植数显著降低。附图说明图1：丹皮酚抑制沙门氏菌Ⅲ型分泌系统的功能图2：丹皮酚不影响鼠伤寒沙门氏菌的正常生长图3：丹皮酚对沙门氏菌介导的HeLa细胞损伤的保护作用图4：丹皮酚提高沙门氏菌感染小鼠保护率图5：丹皮酚降低沙门氏菌感染小鼠靶器官菌落定植数具体实施方式通过以下实施进一步举例描述本专利技术，并不以任何方式限制本专利技术，在不背离本专利技术的技术解决方案的前提下，对本专利技术所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本专利技术的权利要求范围之内。实施例1丹皮酚作为沙门氏菌T3SS抑制剂及在制备治疗沙门氏菌感染药物中的作用，用于药学上可接受的任何载体。实施例2丹皮酚作为沙门氏菌T3SS抑制剂用于制备治疗感染性疾病的药物。实施例3丹皮酚作为沙门氏菌T3SS抑制剂用于治疗细菌引起的感染性疾病，特别是由沙门氏菌引起的人畜感染，包括伤寒、副伤寒、胃肠炎和鸡白痢等疾病。1.沙门氏菌III型分泌系统抑制剂的筛选以β-内酰胺酶-SipA融合报告系统及其荧光底物CCF-4检测受试天然化合物对沙门氏菌Ⅲ型分泌系统功能的影响，通过天然化合物与沙门氏菌提前共孵育后感染细胞，然后以感染细胞后呈现不同颜色荧光信号进行抑制剂的筛选。结果表明：与阳性对照组相比(T3SS效应蛋白SipA能够正常转运至细胞内，细胞呈蓝色荧光)，丹皮酚在浓度为16μg/ml时可以显著抑制沙门氏菌T3SS效应蛋白SipA由胞外转运至胞内，失去正常功能(视野内绝大部分细胞呈绿色荧光)，与沙门氏菌invA基因敲除株感染组结果相似(invA是介导T3SS系统效应蛋白转运的关键基因，敲除后失去正常的功能，因此细胞呈绿色荧光)，该结果说明丹皮酚通过抑制沙门氏菌Ⅲ型分泌系统效应蛋白SipA的转运而抑制沙门氏菌T3SS的功能(见附图1)。2.丹皮酚对沙门氏菌生长的影响将沙门氏菌于LB(含0.3MNaCl)液体培养基内过夜培养(37℃，200rpm，次日1:100扩大培养至OD600nm值为0.3左右，平均分装至锥形瓶后，设定为阳性组和不同浓度药物共孵育组。37℃，200rpm继续培养，每隔30min用紫外分光光度计测定并记录每组各个样品的OD600nm，直至细菌生长至平台期。沙门氏菌生长曲线图显示丹皮酚在16～128μg/ml的浓度范围内未显著抑制沙门氏菌的生长，与未加丹皮酚组相差无异，说明丹皮酚在有效浓度范围内并不影响细菌的正常生长(见附图2)。3.丹皮酚对沙门氏菌介导的HeLa细胞损伤的保护作用按照细胞乳酸脱氢酶(LDH)检测方法进行丹皮酚对沙门氏菌介导的HeLa细胞损伤的保护试验，即沙门氏菌感染HeLa细胞后导致细胞死亡，以细胞死亡后释放的LDH定量沙门氏菌感染细胞的死亡率，并通过与预先经丹皮酚处理的沙门氏菌感染HeLa细胞介导的细胞死亡率进行比较。沙门氏菌悬液的准备：自培养沙门氏菌的LB琼脂固体平板挑单菌落于LB液体培养基内37℃，180rpm震荡过夜培养，次日1:100于新鲜LB液体培养基扩大培养，并加入不同终浓度的丹皮酚，37℃，180rpm共培养4h，根据感染复数(MOI，细菌感染数量与细胞数量比值)制备一定浓度的菌悬液。细胞感染及LDH测定：96孔板内每孔接种2.0×104个HeLa细胞后过夜培养，待次日细胞生长融合率在80％以上时进行试验，分别设定为阴性对照组(DMEM培养，不加菌不加药)，不同浓度丹皮酚处理沙门氏菌感染组(经不同浓度丹皮酚预处理的沙门氏菌)和阳性对照组(0.2％TritonX-100，能够使细胞充分裂解死亡)。感染组按MOI＝100进行感染，阴性对照组和阳性对照组分别加入相同体积的DMEM和0.1％TritonX-100，1000rpm离心10min后于37℃温箱培养8h。1000rpm离心10min，取细胞培养上清于新的96孔板，按照乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒使用说明测定492nm处吸光度，计算各组LDH释放率并计算和分析各组细胞的死亡率。计算公式如下：LDH释放率(％)＝(待测组-DMEM对照组)/(0.1％TritonX-100组-DMEM对照组)结果表明：丹皮酚在浓度为8μg/ml的预处本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.丹皮酚在制备沙门氏菌III型分泌系统抑制剂及其抗沙门氏菌感染药物中的应用。/n
【技术特征摘要】
1.丹皮酚在制备沙门氏菌III型分泌系统抑制剂及其抗沙门氏菌感染药物中的应用。
2.如权利要求1所述丹皮酚在制备治疗沙门氏菌感染药物中的应用，其特征在于所...
【专利技术属性】
技术研发人员：王建锋，吕强华，李淑芳，张勇，张福成，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22
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