本发明专利技术提供了一种定量检测氧化低密度脂蛋白的时间分辨免疫层析试剂盒，所述试剂盒包括样本稀释液、测试卡和复制有人氧化低密度脂蛋白标准曲线信息的ID卡，其中所述测试卡由PVC板、样品垫、标记垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组成，所述标记垫上喷制有标记抗Ox‑LDL抗体的Eu荧光微球。本试剂盒只需要在常温对5ul血液样本进行检测，相对传统检测具有采血量少、快速灵敏、准确度好、特异性高、稳定性好的特点。
【技术实现步骤摘要】
定量检测氧化低密度脂蛋白的时间分辨免疫层析试剂盒及应用
本专利技术属于生物医学检测领域，具体涉及一种定量测定人体血浆中氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)浓度时间分辨免疫层析技术的快速检测试剂盒。
技术介绍
低密度脂蛋白(LDL)结构是一个近似球形的乳状液颗粒结构模型。球形的内部呈中性，为胆固醇酯和少量的甘油三酯；外层为亲水亲油的单分子层，包括磷脂、未酯化的胆固醇以及一个分子的载脂蛋白apoB-100。LDL中磷脂、胆固醇以及蛋白质非常容易受到氧自由基和羟自由基的攻击而被氧化成为氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)。在体内LDL可以通过以下两种方式进行氧化:(1)动脉内皮细胞可以在氧自由基的介导下经细胞内脂加氧酶作用,使LDL氧化修饰；(2)过度金属离子(如Cu2+、Fe2+)同样可以在氧自由基介导下,使脂蛋白卵磷脂分子中的多不饱和脂肪酸(PUFAs)产生脂过氧基诱导的氧化修饰。研究表明，Ox-LDL可引起血管内皮细胞损伤,诱导单核细胞与内皮细胞的黏附,导致巨噬细胞的泡沫化，形成泡沫细胞。而泡沫细胞的形成将促使脂类在动脉壁的沉积，是动脉粥样硬化的主要病因之一。故Ox-LDL作为动脉粥样硬化的独立的危险因素,在动脉粥样硬化的发生、发展过程中发挥了重要的作用。研究表明，患者体内的Ox-LDL量远高于正常人，其浓度与病变范围呈正相关。高水平的Ox-LDL可能代表体内有强的氧化应激反应。它在影响斑块稳定性方面发挥作用。因此，Ox-LDL作为新一代独立检测指标，在冠心病的预警及早期辅助诊断具有重要意义。目前测定氧化低密度脂蛋白的几种方法包括：1)传统的共轭双烯法、硫代巴比妥酸化学测定法、相对电泳迁移速率法、ELISA法等，都存在检测样本因为反应时间长、操作复杂且不适合单人份即时操作，样本容易被氧化而导致不准确的缺点；2)胶乳增强比浊法是一种通过在高分子乳胶微球表面交联的单克隆抗体，而当抗原与交联有抗体的微球结合后，能够在短时间内迅速聚集在一起，改变反应溶液的吸光度，从而确定样品中Ox-LDL的含量的方法，但此方法检测Ox-LDL存在灵敏度差的缺点，难以满足临床的检测需求。3)化学发光法，灵敏度高，但操作繁琐，需要特殊的发光底物-抗原/抗体连接物、需要大型分析仪器、试剂成本较高等缺点，限制了其大规模的发展使用。因此，有必要开发一种同时具有高灵敏度、宽线性范围、特异性好且操作简便，适合于社区医院和基层医疗机构的试剂盒。
技术实现思路
因此，本专利技术的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种定量检测氧化低密度脂蛋白的时间分辨免疫层析试剂盒及应用。在阐述本专利技术的技术方案之前，定义本文中所使用的术语如下：术语“Ox-LDL”是指：氧化低密度脂蛋白。术语“LDL”是指：低密度脂蛋白。术语“NC”是指：硝酸纤维素。术语“PVC”是指：聚氯乙烯。术语“APOB”是指：载脂蛋白B。术语“BSA”是指：牛血清白蛋白。术语“PBS缓冲液”是指：磷酸缓冲盐溶液。为实现上述目的，本专利技术的第一方面提供了一种定量检测氧化低密度脂蛋白的时间分辨免疫层析试剂盒，所述试剂盒包括样本稀释液、测试卡和复制有人氧化低密度脂蛋白标准曲线信息的ID卡，其中所述测试卡由PVC板、样品垫、标记垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组成，所述标记垫上喷制有标记抗Ox-LDL抗体的Eu荧光微球。根据本专利技术第一方面的试剂盒，其中，所述硝酸纤维素膜上划有一条抗APOB单克隆抗体检测线和一条羊抗鼠多克隆抗体质控线。根据本专利技术第一方面的试剂盒，其中，所述结合垫上包括Eu荧光微球标记的人氧化低密度脂蛋白抗体。根据本专利技术第一方面的试剂盒，其中，所述Eu荧光微球为粒径为200～300nm，优选为200～250nm，最优选为210nm聚苯乙烯-羧基微球；优选地，所述Eu荧光微球表面无修饰直链手臂、表面修饰6原子直链手臂、表面修饰200原子直链手臂、表面修饰1000原子直链手臂；更优选地，所述Eu荧光微球表面修饰6原子直链手臂。根据本专利技术第一方面的试剂盒，其中，所述样本稀释液包括0.05MpH8.0的Tris-HCl缓冲液，0.5％的Proclin300，0.2％BSA,0.2％(v/v)Tween-20，0.5％(w/v)brij-35，0.1(w/v)维生素C。根据本专利技术第一方面的试剂盒，其中，所述试剂盒中还包括校准品稀释液；优选地，所述校准品稀释液包括0.02MpH7.4的PBS缓冲液，0.5％的Proclin300，3g/LBSA，0.5g/L乙二胺四乙酸二钠，1％人血白蛋白。根据本专利技术第一方面的试剂盒，其中，所述标记抗Ox-LDL抗体的Eu荧光微球通过Eu-荧光微球与抗Ox-LDL抗体经活化、偶联、封闭制备得到；优选地，所述方法包括以下步骤：(A)Eu荧光微球活化：吸取Eu荧光微球到离心管中，加入硼酸缓冲溶液至浓度1～3mg/ml，振荡混匀；加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液室温振荡活化；(B)抗体与微球偶联：将步骤(A)中活化好的微球离心弃上清，用硼酸缓冲溶液复溶；加入抗Ox-LDL抗体抗体，至终浓度200～400g/ml室温振荡孵育；(C)封闭：在步骤(B)所得抗体偶联混合液中，加入含有BSA的Tris-HCl封闭液2-8℃封闭；(D)储存：封闭后的抗体荧光微球洗涤离心弃上清，加入微球保存液，放入2-8℃条件下保存；更优选地，所述微球保存液包括0.05MpH8.0的Tris-HCl缓冲液，含2％(w/v)BSA，3％(w/v)海藻糖，10％(w/v)蔗糖，0.2％(v/v)Tween-20，0.1％(v/v)Proclin300。本专利技术的第二方面提供了第一方面所述的试剂盒的制备方法，该制备方法可以包括以下步骤：所述方法包括以下步骤：(1)分别制备标记垫、结合垫、硝酸纤维素膜；(2)将硝酸纤维素膜光面向下贴到PVC板中间位置，质控线在上，检测线在下；(3)沿硝酸纤维素膜下缘粘贴结合垫，优选地，所述结合垫与硝酸纤维素膜重叠1～1.5mm；(4)沿结合垫下边缘粘贴标记垫；优选地，所述结合垫与标记垫重叠1～1.5mm；(5)沿标记垫下边缘贴样品垫，优选地，所述标记垫与结合垫边缘重叠1～1.5mm；和(6)将吸水纸贴于PVC板上，优选地，所述吸水纸硝酸纤维素膜重叠2～3mm。根据本专利技术第二方面的制备方法，其中，所述步骤(1)中，所述结合垫的制备方法包括以下步骤：用喷金缓冲液配制按照5～20倍、优选为10～20倍、最优选为15倍效价稀释标记微球后，将微球喷制到结合垫上。本专利技术的第三方面提供了第一方面所述的试剂盒在制备用于检测氧化低密度脂蛋白的产品中的应用。针对现有Ox-LDL在测试过程中存在的上述问题，本专利技术提供一种快速灵敏、准确性好、特异性高、稳定性好，操作简便的试剂盒。本专利技术属于生物医学检测领域本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种定量检测氧化低密度脂蛋白的时间分辨免疫层析试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括样本稀释液、测试卡和复制有人氧化低密度脂蛋白标准曲线信息的ID卡，其中所述测试卡由PVC板、样品垫、标记垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组成，所述标记垫上喷制有标记抗Ox-LDL抗体的Eu荧光微球。/n
【技术特征摘要】
1.一种定量检测氧化低密度脂蛋白的时间分辨免疫层析试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括样本稀释液、测试卡和复制有人氧化低密度脂蛋白标准曲线信息的ID卡，其中所述测试卡由PVC板、样品垫、标记垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组成，所述标记垫上喷制有标记抗Ox-LDL抗体的Eu荧光微球。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述硝酸纤维素膜上划有一条抗APOB单克隆抗体检测线和一条羊抗鼠多克隆抗体质控线。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述结合垫上包括Eu荧光微球标记的人氧化低密度脂蛋白抗体。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述Eu荧光微球为粒径为200～300nm，优选为200～250nm，最优选为210nm聚苯乙烯-羧基微球；
优选地，所述Eu荧光微球表面无修饰直链手臂、表面修饰6原子直链手臂、表面修饰200原子直链手臂、表面修饰1000原子直链手臂；
更优选地，所述Eu荧光微球表面修饰6原子直链手臂。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述样本稀释液包括0.05MpH8.0的Tris-HCl缓冲液，0.5％的Proclin300，0.2％BSA,0.2％(v/v)Tween-20，0.5％(w/v)brij-35，0.1(w/v)维生素C。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括校准品稀释液；
优选地，所述校准品稀释液包括0.02MpH7.4的PBS缓冲液，0.5％(v/v)的Proclin300，3g/LBSA，0.5g/L乙二胺四乙酸二钠，1％人血白蛋白。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述标记抗Ox-LDL抗体的Eu荧光微球通过Eu-荧光微球与抗Ox-LDL抗体经活化、偶联、封闭制备得到；
优选地，所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴建榕，刘永，黄龙耀，丁琪，王峥辉，
申请(专利权)人：北京协和洛克生物技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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