一种水稻硝酸还原酶NIA3蛋白基因OsNia3及其应用制造技术

水稻硝酸还原酶NIA3蛋白基因OsNia3，其cDNA序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的水稻NIA3蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；利用转基因技术获得水稻基因OsNia3的纯合敲除突变体和纯合OsNia3过表达株系，分析发现OsNia3基因敲除株系的株高变矮，生育期缩短，单株产量减少；而OsNia3过表达株系的株高较高，生育期延长，单株产量增加，水稻硝酸还原酶NIA3蛋白基因OsNia3可作为目的基因导入植物，以提高植物氮素利用效率，进行植物品种改良。

A rice nitrate reductase nia3 protein gene osnia3 and its application

【技术实现步骤摘要】
一种水稻硝酸还原酶NIA3蛋白基因OsNia3及其应用
本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及一种水稻硝酸还原酶NIA3蛋白基因OsNia3及其应用。
技术介绍
植物主要以硝酸盐和铵盐的形式从土壤中吸收氮元素，硝酸盐同化是受到高度调控的氮素利用过程[1]。硝酸盐降解的第一步发生在细胞质中，由硝酸还原酶(Nitratereductase,NR)将硝酸盐还原成亚硝酸盐，亚硝酸盐进入叶绿体或质体后，经过后续一系列的代谢反应被植物体所利用。目前研究发现，拟南芥中存在两个硝酸还原酶基因(AtNia1和AtNia2)，其编码分别是NIA1和NIA2蛋白[2]。敲除AtNia1和AtNia2后，拟南芥突变体NR活性显著降低，而nia1nia2双敲除突变体中几乎检测不到NR活性[3]，在拟南芥中过量表达Nia基因，能够增强转基因株系的NR活性，降低植株内硝酸盐的积累[4]。拟南芥中NR活性主要受基因AtNia2控制，AtNia2基因突变将导致90％NR活性的丧失[5]。水稻中含有2个硝酸还原酶基因，分别为OsNia1和OsNia2[6]。从NCBI中(htt本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.水稻硝酸还原酶NIA3蛋白基因OsNia3，其特征在于，其cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.水稻硝酸还原酶NIA3蛋白基因OsNia3，其特征在于，其cDNA序列如SEQIDNO.1所示。


2.根据权利要求1所述的水稻硝酸还原酶NIA3蛋白基因OsNia3，其特征在于，利用水稻硝酸还原酶NIA3蛋白基因OsNia3编码的水稻蛋白NIA3，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。


3.根据权利要求1所述的水稻硝酸还原酶NIA3蛋白基因OsNia3，其特征在于，应用于水稻基因OsNia3敲除载体pCas9-OsNia3。


4.根据权利要求3所述的水稻硝酸还原酶NIA3蛋白基因OsNia3，其特征在于，水稻基因OsNia3敲除载体pCas9-OsNia3是将是将水稻硝酸还原酶NIA3蛋白基因OsNia3的18bp序列连接至pCas9载体所得。


5.根据权利要求1所述的水稻硝酸还原酶NIA3蛋白基因OsNia3，其特征在于，应用于水稻基因OsNia3表达载体pCUBi1390-GFP-OsNia3。


6.根据权利要求5所述的水稻硝酸还原酶NIA3蛋白基因OsNia3，其特征在于，水稻基因OsNia3表达载体pCUBi1390-GFP-OsNia3是将水稻基因OsNia3的cDNA克隆至载体双元表达载体pCUBi1390-GFP中HandIII和BamHI酶切位点所得。


7.根据权利要求1所述的水稻硝酸还原酶NIA3蛋白基因OsNia3，其特征在于，应用在水稻转基因植株上，具体步骤如下：
1)提取总RNA
选用水稻品种Kitaake作为RNA的提取材料，待水稻幼苗生长至约20d，取叶片液氮冻存；而后取部分液氮冻存叶片，用研钵研碎，按照RNAprepPure植物总RNA提取试剂盒说明提取水稻叶片总RNA；
2)克隆水稻基因OsNia3
从NCBI中搜索Nia1基因的mRNA序列，发现Nia1基因的mRNA与[NADH]1-like的mRNA高度同源，后续实验将其命名为水稻基因OsNia3，根据水稻基因OsNia3的全长序列，设计两端引物P1:SEQIDNO.3和P2:SEQIDNO.4；
将步骤1)获得的水稻叶片总RNA转录合成cDNA第一链，并以cDNA第一链为模版，采用高保真KODFX酶进行PCR扩增，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收，将目的基因与pCUbi1390-GFP过表达载体进行连接获得过表达载体pCUbi1390-GFP-Nia3，测序获得水稻基因OsNia3的cDNA序列SEQIDNO.1及其编码的水稻蛋白NIA3氨基酸序列SEQIDNO.2；
3)构建水稻基因OsNia3敲除载体pCas9-OsNia3
根据步骤2)获得的水稻基因OsNia3的全长cDNA序列，利用CRISPR-P在线网站设计引物片段，而后将设计的引物片段序列与pCas9载体上的sgRNA骨架部分序列一起黏贴至RNAfoldWebserver中进行RNA结构预测，获得引物片段P3:SEQIDNO.5，再将引物片段P3:SEQIDNO.5加上接头序列获得引物片段P4:SEQIDNO.6及其反向互补序...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴自明，韩瑞才，徐志荣，李祖军，何汛锋，曾勇军，曾研华，
申请(专利权)人：江西农业大学，
类型：发明
国别省市：江西;36