一种水溶性菁染料偶联物的纯化方法及应用技术

本申请公开了一种水溶性菁染料偶联物的纯化方法及应用。本申请的纯化方法，包括采用阴离子交换树脂对水溶性菁染料偶联物进行吸附，使其与不带电荷或者带正电荷的杂质分离，再分别采用水和不同盐离子浓度的溶液对吸附水溶性菁染料偶联物的阴离子交换树脂进行洗脱，分段接收目标成份，获得纯化的水溶性菁染料偶联物。本申请的纯化方法，利用阴离子交换树脂的吸附/解吸附分离纯化偶联物，溶解样品可以用水，降低了样品前处理难度，也减少了样品被污染的概率，利于工业化规模生产。利用阴离子交换树脂吸附分离，更方便快捷，成本低、效率高。在洗脱时流动相采用水和盐溶液即可，避免了使用有机溶剂对环境的污染。

Purification and application of a water soluble cyanine dye coupling compound

【技术实现步骤摘要】
一种水溶性菁染料偶联物的纯化方法及应用
本申请涉及水溶性菁染料偶联物纯化领域，特别是涉及一种水溶性菁染料偶联物的纯化方法及应用。
技术介绍
荧光染料，在吸收紫外线或可见光后，能把短波长的光转化为长波长的可见光发射出来，呈现闪亮的颜色，例如，酸性曙红、荧光黄、红汞以及某些分散染料等。它们大多是含有苯环或杂环并带有共轭双键的化合物。菁染料是一类性能优良的荧光标记染料，包括Cy3、Cy5、Cy5.5和Cy7等一系列不对称的水溶性荧光分子。它们的摩尔吸光系数很高，具有良好的稳定性，被广泛用于蛋白、抗体、核酸及其它生物分子的标记和检测。目前，Cy3和Cy5已成为基因芯片的首选荧光标记物。另外，Cy系列的染料，其吸收在近红外区，背景非常低，是荧光强度最高、最稳定的长波长染料，特别适合用来替代放射性元素，在活体小动物体内成像。由于菁染料激发波长在600-1000nm的近红外区，可以有效的避免被标记物自荧光的干扰。水溶性菁染料偶联物是指水溶性菁与一段linker连接后形成的水溶性的偶联物；其中，水溶性菁可以是水溶性的Cy3、Cy5、Cy5.5或Cy7，linker根据不同的使用需求而定，例如可以是聚乙二醇、炔丙基胺或者3-叠氮丙基-1-胺等。以比较常见的Cy5为例，在基因测序时，一般将水溶性Cy5染料连接一段聚乙二醇(缩写PEG)linker，然后连接到基因芯片上。又例如，可以利用共价键将水溶性菁染料与linker相连，当作特异性的荧光探针来使用，其中的linker可以采用炔丙基胺或者3-叠氮丙基-1-胺等。另外，Cy5是目前测序中最常使用的一种荧光染料，例如将Cy5通过linker连接到G碱基上，利用碱基互补配对原则，在酶的作用下，将带有荧光染料的核苷酸结合到待测序列上，然后通过荧光信号读取碱基信息。以上这些水溶性菁染料Cy5偶联物，统一简称为Cy5-linker或Cy5偶联物。所有依赖于Cy5偶联物的技术中，Cy5偶联物的纯度都是其技术实现或者有效实施的关键，也是限制这些技术的瓶颈。所以对于水溶性菁染料Cy5偶联物的纯化至关重要。同样的，Cy3偶联物、Cy5.5偶联物和Cy7偶联物的纯度也是限制其应用的重要因素。菁染料与linker连接反应的副反应多，副产物极性相近，产物的分离提纯相当困难。由于水溶性的菁染料分子极性大，使得分离提纯越加困难。目前通常采用制备型的HPLC进行分离纯化，该方法需要用到昂贵的制备型HPLC、制备柱和HPLC级的洗脱剂，设备十分昂贵，投入巨大。其中，HPLC级的洗脱剂一般由水和HPLC级的乙腈组成；而HPLC级的乙腈价格昂贵，且对环境有污染。并且，制备型的HPLC分离纯化的通量很小，不利于工业化生产。同样以Cy5为例，对于Cy5偶联物来说，Cy5与Cy5偶联物的极性相当，采用制备型的HPLC分离纯化，要通过多次过HPLC制备柱才能实现分离，成本高、效率低。
技术实现思路
本申请的目的是提供一种新的水溶性菁染料偶联物的纯化方法及应用。本申请采用了以下技术方案：本申请的一方面公开了一种水溶性菁染料偶联物的纯化方法，水溶性菁染料偶联物为水溶性的Cy3偶联物、Cy5偶联物、Cy5.5偶联物和Cy7偶联物中的至少一种，本申请的纯化方法包括采用阴离子交换树脂对水溶性菁染料偶联物进行吸附，使其与不带电荷或者带正电荷的杂质分离，然后分别采用水和不同盐离子浓度的溶液对吸附水溶性菁染料偶联物的阴离子交换树脂进行洗脱，分段接收目标成份，去除洗脱液，即获得纯化的水溶性菁染料偶联物。需要说明的是，本申请的水溶性菁染料偶联物是指，菁染料与linker连接后，仍然具有水溶性的Cy3偶联物、Cy5偶联物、Cy5.5偶联物或Cy7偶联物；本申请利用阴离子交换树脂与带负电荷的水溶性菁染料偶联物发生正负电荷吸附作用，使得水溶性菁染料偶联物吸附固定在阴离子交换树脂上，从而率先将不带电荷或者带正电荷的杂质分离去除。然而，在水溶性菁染料偶联物中，还有与其极性相当的原材料水溶性菁染料，水溶性菁染料同样带负电荷，也会被阴离子交换树脂吸附。但是，由于水溶性菁染料和水溶性菁染料偶联物，两者的分子量不同，因此，可以采用不同盐离子浓度的流动相，通过增加流动相的盐离子浓度的方式进行洗脱分离，分段接收目标成份，获得高纯度的水溶性菁染料偶联物，本申请的一种实现方式中水溶性菁染料偶联物的纯度大于95％。可以理解，本申请的纯化方法主要是利用水溶性菁染料或水溶性菁染料偶联物带负电荷能够被阴离子交换树脂吸附，因此，只要linker连接后水溶性菁染料偶联物仍然带负电荷，都可以采用本申请的方法进行纯化，至于具体的linker可以根据不同的使用需求而定，在此不做具体限定。优选的，不同盐离子浓度的溶液包括三乙胺-碳酸缓冲溶液，以及水与三乙胺-碳酸缓冲溶液不同比例混合的混合溶液。优选的，水与三乙胺-碳酸缓冲溶液不同比例混合的混合溶液，具体包括以下混合溶液中的至少一种，水与三乙胺-碳酸缓冲溶液体积比为4:1的混合溶液、水与三乙胺-碳酸缓冲溶液体积比为2:1的混合溶液、水与三乙胺-碳酸缓冲溶液体积比为1:1的混合溶液、水与三乙胺-碳酸缓冲溶液体积比为1:2的混合溶液、水与三乙胺-碳酸缓冲溶液体积比为1:4的混合溶液。优选的，三乙胺-碳酸缓冲溶液的浓度为1mol/L。需要说明的是，以上流动相是本申请一种实现方式中，经过验证的具体可行的不同盐离子浓度进行洗脱的方案，不排除可以采用其它的洗脱液，当然，其它洗脱液与去离子水的具体比例可以根据试验调整，在此不做具体限定。优选的，分段接收目标成份，具体包括，检测器紫外谱，在水溶性菁染料偶联物中水溶性菁染料的最大吸收波长处分段接收目标馏分。需要说明的是，本申请的一种实现方式中，是Cy5偶联物是在检测器254nm和650nm紫外谱分段接收目标馏分的，因为Cy5的最大吸收波长是650nm。优选的，在水溶性菁染料偶联物中水溶性菁染料的最大吸收波长处分段接收目标馏分，具体包括，将分段接收的纯度大于设定阈值的馏分合并，获得目标馏分，将纯度小于设定阈值的馏分回收再次进行阴离子交换树脂吸附、洗脱，以提高产率。需要说明的是，本申请的一种实现方式中，纯度检测采用HPLC检测，优选的将纯度为95％的馏分合并，制备纯化的水溶性菁染料偶联物，其余馏分则可以根据需求回收利用，再次进行纯化。需要说明的是，将纯度大于设定阈值的馏分合并，其目的是获得高纯度的水溶性菁染料偶联物产品，根据不同的产品纯度需求，这个设定阈值可以是95％，也可以更高，例如96％、97％、98％或99％。可以理解，设定阈值越高，合并的纯度大于设定阈值的馏分中水溶性菁染料偶联物的总量越小，产率越低；因此，本申请进一步的，还包括将纯度小于设定阈值的馏分回收后再次进行阴离子交换树脂吸附、纯化，以提高产率。虽然，可以将纯度小于设定阈值的馏分回收，但是，如果设定阈值越大，回收馏分的量也越大，对回收次数的要求也越高，例如需要更多次的反复回收，才能达到理想的产率，这无疑会增加工作量和成本。因此，根据产品使用需求，本申本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种水溶性菁染料偶联物的纯化方法，所述水溶性菁染料偶联物为水溶性的Cy3偶联物、Cy5偶联物、Cy5.5偶联物和Cy7偶联物中的至少一种，其特征在于：包括采用阴离子交换树脂对水溶性菁染料偶联物进行吸附，使其与不带电荷或者带正电荷的杂质分离，然后分别采用水和不同盐离子浓度的溶液对吸附水溶性菁染料偶联物的阴离子交换树脂进行洗脱，分段接收目标成份，去除洗脱液，即获得纯化的水溶性菁染料偶联物。/n

【技术特征摘要】
1.一种水溶性菁染料偶联物的纯化方法，所述水溶性菁染料偶联物为水溶性的Cy3偶联物、Cy5偶联物、Cy5.5偶联物和Cy7偶联物中的至少一种，其特征在于：包括采用阴离子交换树脂对水溶性菁染料偶联物进行吸附，使其与不带电荷或者带正电荷的杂质分离，然后分别采用水和不同盐离子浓度的溶液对吸附水溶性菁染料偶联物的阴离子交换树脂进行洗脱，分段接收目标成份，去除洗脱液，即获得纯化的水溶性菁染料偶联物。


2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：所述不同盐离子浓度的溶液包括三乙胺-碳酸缓冲溶液，以及水与三乙胺-碳酸缓冲溶液不同比例混合的混合溶液。


3.根据权利要求2所述的纯化方法，其特征在于：所述水与三乙胺-碳酸缓冲溶液不同比例混合的混合溶液，具体包括以下混合溶液中的至少一种，
水与三乙胺-碳酸缓冲溶液体积比为4:1的混合溶液、水与三乙胺-碳酸缓冲溶液体积比为2:1的混合溶液、水与三乙胺-碳酸缓冲溶液体积比为1:1的混合溶液、水与三乙胺-碳酸缓冲溶液体积比为1:2的混合溶液、水与三乙胺-碳酸缓冲溶液体积比为1:4的混合溶液；
优选的，三乙胺-碳酸缓冲溶液的浓度为1mol/L。


4.根据权利要求1-3任一项所述的纯化方法，其特征在于：所述分段接收目标成份，具体包括，根据检测器紫外谱，在水溶性菁染料偶联物中水溶性菁染料的最大吸收波长处分段接收目标馏分。


5.根据权利要求4所述的纯化方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：周超，李汉东，章文蔚，蓝温龙，张振华，
申请(专利权)人：深圳华大生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44