一种稳定的25-羟基维生素D化学发光免疫检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种稳定的25‑羟基维生素D化学发光免疫检测试剂盒，包括试剂R1、试剂R2、试剂R3、试剂R4和试剂R5；其中：R1为包含链霉亲和素磁颗粒的缓冲液，R2为包含化学发光标记物标记的25‑羟基维生素D多克隆抗体和保护剂的缓冲液，R3为包含生物素结合的维生素的小分子抗原衍生物和保护剂的缓冲液，R4和R5为样本预处理试剂，用于解离血清或血浆中以结合蛋白形式存在的25‑羟基维生素D。本发明专利技术的试剂盒将酪蛋白胶束作为保护剂添加在试剂缓冲液中，用于检测血清或血浆中25‑羟基维生素D的含量，有效提高了抗原衍生物的稳定性及测试结果的准确性，解决了现有技术中存在的缺陷问题，便于试剂的储存于运输。

A stable chemiluminescent immunoassay kit for 25 hydroxyvitamin D

【技术实现步骤摘要】
一种稳定的25-羟基维生素D化学发光免疫检测试剂盒
本专利技术涉及体外检测
，尤其涉及一种稳定的25-羟基维生素D化学发光免疫检测试剂盒。
技术介绍
维生素D为类固醇衍生物，属脂溶性维生素。维生素D主要由人体皮肤经紫外线照射后合成，少部分从食物或补充品中摄入。维生素D不仅仅影响钙磷代谢，而且具有广泛的生理作用，是维持人体健康、细胞生长和发育的必不可少的物质，与多种疾病密切相关。在人体内有两种形式的维生素D，维生素D3(胆钙化醇)和维生素D2(麦角钙化醇)，维生素D在肝脏中通过羟基化作用转化成25-羟基维生素D(25-OHVD)，然后在肾脏中转换为具有活性的1,25-二羟基维生素D。维生素D的其他代谢物，以比25-羟基维生素D低至一千倍的浓度进行循环，对总的循环维生素D代谢物的评价没有显著贡献。25-羟基维生素D是维生素D在体内的主要存在形式，其半衰期较长且波动小，通过检测它可以确定整个维生素D的情况，因此血清25-OHVD含量是目前国际公认的衡量机体VD营养状态的指标。现已有的25-OHVD检测方法有放射免疫法(RIA)，酶联免疫法(ELISA)，化学发光法(CLIA)，液相色谱-串联质谱法(LC-MS)。其中化学发光法以其灵敏度高，线性范围宽，无污染，操作方便等优势，成为发展趋势。在检测25-羟基维生素D时，需要用到25-羟基维生素D抗原衍生物，然而，25-羟基维生素D抗原衍生物是一种稳定性差，对光和热非常敏感的物质，遇光、遇热时，将失去与双键相连的α氢原子成为烯丙基自由基，同时VD中的22碳易被氧化而断裂使其结构破坏。因此，由于25-羟基维生素D抗原衍生物的不稳定性，导致测定试剂盒不能长期稳定保存。此外，由于稳定性差导致试剂盒不方便储存及运输的缺点也影响了测试试剂的使用及检测结果，这也是目前25-羟基维生素D检测技术上存在的最大问题。酪蛋白是一种含磷钙的结合蛋白，直径为200nm的近似球状的复合物，即“酪蛋白胶束”。他的功能受其组成和灵活构像的控制，其耐热性较强，在低于100℃的温度加热时，酪蛋白的化学性质不受影响，同时对紫外线、高压及酶消化等外部环境的改变具有稳定性，保障了负载生物活性物质的作用活性。本专利利用酪蛋白上述的特点，作为保护剂添加在试剂缓冲液中，提高25-羟基维生素D测定试剂盒的稳定性，便于试剂的储存于运输。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种稳定的25-羟基维生素D化学发光免疫检测试剂盒，将酪蛋白胶束作为保护剂添加在试剂缓冲液中，有效提高了抗原衍生物的稳定性及测试结果的准确性，解决了现有技术中存在的缺陷问题，用于检测血清或血浆中25-羟基维生素D的含量。为了实现上述目的，本专利技术提供的技术方案如下：本专利技术提供了一种稳定的25-羟基维生素D化学发光免疫检测试剂盒包括试剂R1、试剂R2、试剂R3、试剂R4和试剂R5；其中：R1为包含链霉亲和素磁颗粒的缓冲液，R1中链霉亲和素磁颗粒的浓度为0.01％～1％，所述磁颗粒的粒径是0.05～3μm；R2为包含化学发光标记物标记的25-羟基维生素D多克隆抗体和保护剂的缓冲液，R2中保护剂采用浓度为0.1％～2％的酪蛋白胶束，化学发光标记物标记的25-羟基维生素D多克隆抗体的浓度为0.15μg/mL，抗体与标记物的标记比例是1:3～1:20；R3为包含生物素结合的维生素的小分子抗原衍生物和保护剂的缓冲液，R3中保护剂采用浓度为0.1％～2％的酪蛋白胶束，生物素结合的维生素的小分子抗原衍生物的浓度为0.05μg/mL；R4为样本预处理试剂1，具体为含有2～10mM还原剂的0.1M～1M碳酸酯缓冲液；R5为样本预处理试剂2，具体为0.1M～0.5M氢氧化钠溶液。优选地，所述保护剂为酪蛋白、酪蛋白酸钠、琥珀酸酪蛋白、重组酪蛋白酸钠和重组琥珀酸酪蛋白的一种或多种。优选地，R2中的化学发光标记物为吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺或三联吡啶钌。优选地，R4中的还原剂选自二硫苏糖醇，碳酸酯选自碳酸乙烯酯。优选地，所述缓冲液为HEPES缓冲液、PIPES缓冲液、MOPS缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、BISTRIS缓冲液、TRIS缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液中的一种或多种。具体地，上述的稳定的25-羟基维生素D化学发光免疫检测试剂盒中，R1中链霉亲和素磁颗粒的制备方法为：取浓度50～100mg/ml的链霉亲和素磁颗粒溶液，加入10倍体积的TBST溶液充分混匀，放置于磁分离器上，直至上清无混浊，弃上清，留取磁颗粒；重复清洗3次后采用含50mMMES、0.05％吐温-20、0.05％Proclin300，pH6.5的缓冲液中配成磁珠浓度为0.01％～1％的固相试剂，2℃～8℃保存。R2中化学发光标记物标记的25-羟基维生素D抗体的制备方法为：将25-羟基维生素D抗体离心20s～30s后加入碳酸缓冲溶液，充分混匀，混匀后加入2mg/mL化学发光标记物吖啶酯DMF溶液，离心0.5min～1min，密封后避光混匀3h～4h；加入20％～30％赖氨酸封闭液，混匀后封闭1h～2h；将封闭好的抗体纯化、收集，用50mMMES、0.05％吐温、0.05％Proclin300、pH6.5的缓冲液稀释至终浓度为0.1μg/mL，2℃～8℃保存。R3中生物素结合的维生素的小分子抗原衍生物的制备方法为：用DMSO将生物素结合的维生素粉末进行复溶，得到浓度为1mg/mL的一级稀释液；再用DMSO稀释一级稀释液得到浓度为20μg/mL的二级稀释液，-80℃保存；使用时将二级稀释液，用400mMBistris丙烷、0.1％吐温-20、0.05％Proclin300、PH8.6的缓冲液稀释至终浓度为0.05μg/mL，2℃～8℃保存。此外，上述的试剂盒中，还包括25-羟基维生素D校准品，所述校准品包括浓度分别为0.00ng/mL、5.00ng/mL、10.00ng/mL、20.00ng/mL、50.00ng/mL和70.00ng/mL的25-羟基维生素D溶液。优选地，上述稳定的25-羟基维生素D化学发光免疫检测试剂盒中各试剂组成成分如下：R1试剂组成成分：缓冲液10～30mmol/L盐类100～300mmol/L链霉亲和素磁颗粒0.01％～1％R2试剂组成成分：化学发光标记物标记的25-羟基维生素D多克隆抗体0.15μg/mLR3试剂组成成分：R4试剂组成成分：碳酸酯0.1M～1M还原剂2～10mMR5试剂组成成分：氢氧化钠0.1M～0.5M其中所述缓冲液为HEPES缓冲液、PIPES缓冲液、MOPS缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、BISTRIS缓冲液、TRIS缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液中的一种或多种；其中所述的盐类为NaCl、KCl和MgCl2中的一种或多种；其中所述的保护剂为酪蛋白、酪蛋白酸钠、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种稳定的25-羟基维生素D化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，包括试剂R1、试剂R2、试剂R3、试剂R4和试剂R5；/n其中：/nR1为包含链霉亲和素磁颗粒的缓冲液，R1中链霉亲和素磁颗粒的浓度为0.01％～1％，所述磁颗粒的粒径是0.05～3μm；/nR2为包含化学发光标记物标记的25-羟基维生素D多克隆抗体和保护剂的缓冲液，R2中保护剂采用浓度为0.1％～2％的酪蛋白胶束，化学发光标记物标记的25-羟基维生素D多克隆抗体的浓度为0.15μg/mL，抗体与标记物的标记比例是1:3～1:20；/nR3为包含生物素结合的维生素的小分子抗原衍生物和保护剂的缓冲液，R3中保护剂采用浓度为0.1％～2％的酪蛋白胶束，生物素结合的维生素的小分子抗原衍生物的浓度为0.05μg/mL；/nR4为样本预处理试剂1，具体为含有2～10mM还原剂的0.1M～1M碳酸酯缓冲液；/nR5为样本预处理试剂2，具体为0.1M～0.5M氢氧化钠溶液。/n

【技术特征摘要】
1.一种稳定的25-羟基维生素D化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，包括试剂R1、试剂R2、试剂R3、试剂R4和试剂R5；
其中：
R1为包含链霉亲和素磁颗粒的缓冲液，R1中链霉亲和素磁颗粒的浓度为0.01％～1％，所述磁颗粒的粒径是0.05～3μm；
R2为包含化学发光标记物标记的25-羟基维生素D多克隆抗体和保护剂的缓冲液，R2中保护剂采用浓度为0.1％～2％的酪蛋白胶束，化学发光标记物标记的25-羟基维生素D多克隆抗体的浓度为0.15μg/mL，抗体与标记物的标记比例是1:3～1:20；
R3为包含生物素结合的维生素的小分子抗原衍生物和保护剂的缓冲液，R3中保护剂采用浓度为0.1％～2％的酪蛋白胶束，生物素结合的维生素的小分子抗原衍生物的浓度为0.05μg/mL；
R4为样本预处理试剂1，具体为含有2～10mM还原剂的0.1M～1M碳酸酯缓冲液；
R5为样本预处理试剂2，具体为0.1M～0.5M氢氧化钠溶液。


2.根据权利要求1所述的稳定的25-羟基维生素D化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述保护剂为酪蛋白、酪蛋白酸钠、琥珀酸酪蛋白、重组酪蛋白酸钠和重组琥珀酸酪蛋白的一种或多种。


3.根据权利要求1所述的稳定的25-羟基维生素D化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，R2中的化学发光标记物为吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺或三联吡啶钌。


4.根据权利要求1所述的稳定的25-羟基维生素D化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，R4中的还原剂选自二硫苏糖醇，碳酸酯选自碳酸乙烯酯。


5.根据权利要求1所述的稳定的25-羟基维生素D化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述缓冲液为HEPES缓冲液、PIPES缓冲液、MOPS缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、BISTRIS缓冲液、TRIS缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液中的一种或多种。


6.根据权利要求1所述的稳定的25-羟基维生素D化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，R1中链霉亲和素磁颗粒的的制备方法为：取浓度50～100mg/ml的链霉亲和素磁颗粒溶液，加入10倍体积的TBST溶液充分混匀，放置于磁分离器上，直至上清无混浊，弃上清，留取磁颗粒；重复清洗3次后采用含50mMMES、0.05％吐温-20、0.05％Proclin300，pH6.5的缓冲液中配成磁珠浓度为0.01％～1％的固相试剂，2℃～8℃保存。


7.根据权利要求1所述的稳定的25-羟基维生素D化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，R2中化学发光标记物标记的25-羟基维生素D抗体的制备方法为：将25-羟基...

【专利技术属性】
技术研发人员：张丹丹，孟令敏，韩美玉，王凯，高威，孙成艳，何浩会，
申请(专利权)人：迪瑞医疗科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：吉林;22