一种流式细胞仪检测外泌体的方法技术

本发明专利技术提供一种流式细胞仪检测外泌体的方法，包括如下步骤：(1)收集样品，提取外泌体；(2)抗体孵育：将提取的外泌体用含2％BSA的PBS溶液溶解，先后进行一抗和二抗孵育，得到CD63标记的外泌体检测液；(3)流式细胞仪的参数设置：正常运行流式细胞仪，进行参数设置；(4)上机检测：将所述CD63标记的外泌体检测液加入PBS溶液重悬，上机检测；(5)利用流式细胞仪分析软件对数据进行分析，得到外泌体的定量检测结果。本发明专利技术属于生物检测技术领域，可有效对血清、血浆和尿液等不同样品中的外泌体进行定量分析，检测结果特异性强，且操作过程方便、快捷，重复性好。

A method of detecting exosomes by flow cytometry

【技术实现步骤摘要】
一种流式细胞仪检测外泌体的方法
本专利技术属于生物检测
，尤其涉及一种流式细胞仪检测外泌体的方法。
技术介绍
外泌体(exosome)是直径约为30-150nm的微小囊泡。外泌体天然存在于各种体液中，包括血液、唾液、尿液和母乳，是活细胞分泌的来源于晚期核内体(也称为多囊泡体)的膜性囊泡。目前针对外泌体的研究主要集中：(1)外泌体用于疾病的早期诊断；在不同疾病状态下，如肿瘤、糖尿病和炎症等疾病发生时，细胞分泌的外泌体会发生显著变化，通过检测各种体液中的外泌体数量、外泌体表面蛋白或内含物的变化情况达到早期无创诊断疾病的目的；(2)外泌体作为载体在体内进行信号交流；外泌体本身会包裹大量的蛋白或RNA分子，细胞一方面分泌外泌体，另外一方面也会摄取其他细胞分泌的外泌体，这样不同细胞就通过外泌体进行了信息交流。因此，现在的研究主要集中于探究存在于体液中的外泌体是如何介导细胞间和组织间进行信息交流，进而导致某种生理或病理现象的发生。然而，外泌体的研究现如今面临着较大的困境，因为无论针对哪个方面的研究都需要一种精准高效的外泌体检测定量方法，而现如今外泌体的检测技术主要包括：(1)扫描电子显微镜观察形态；该技术对样品的预处理和制备上面要求较高，样品的准备阶段比较复杂，不适合对外泌体进行大量快速的检测，而且由于外泌体经过了复杂的预处理和制备过程，无法准确的进行外泌体浓度的测量；(2)动态光散射技术；由于动态光散射技术是测量光强的波动数据，所以大颗粒的光强波动信号会掩盖较小颗粒的光强波动信号，所以动态光散射不适合大小不一的复杂外泌体样本的测量，只适合通过色谱法制备的大小均一的外泌体的尺寸测量，并且无法测量样品中外泌体的浓度。(3)WesternBlot技术：操作较为繁琐，定量不准确。中国专利申请CN106841613A公开了一种检测外泌体的方法，原理是基于磁微粒化学发光免疫检测机制，包括如下步骤：采集生物样本，收集外泌体分析液，进行蛋白定量；采用偶联有抗外泌体表面标志物单克隆抗体的磁性微粒等组成的检测体系测定；采用偶联有抗外泌体表面标志物单克隆抗体和酶标记抗癌胚抗原CEA单克隆抗体等组成的泌体CEA检测体系测定；计算外泌体CEA阴性亚群和外泌体CEA阳性亚群的比例；基于上述检测结果，建立生物样本的外泌体分布模型。该检测方法虽可用于不同生物样本中外泌体的检测，但分析步骤复杂，不利于实现大量、快速的检测。流式细胞术工作原理是在细胞分子水平上通过单克隆抗体对单个细胞或其他生物粒子进行多参数、快速的定量分析。流式细胞术可以高速分析上万个颗粒，并能同时从一个颗粒中测得多个参数，具有速度快、精度高、准确性好的优点，是当代最先进的细胞或微颗粒定量分析技术之一。传统流式细胞仪针对的样本主要是细胞，散射光的检测极限通常是300-500nm,而大多数细胞外囊泡的直径都在300nm以下。随着科技的发展，BeckmanCoulter公司开发了CytoFLEXS流式细胞仪型号，该型号的机器经过调试后可适用于检测低于100nm的微颗粒，但尚未被开发用于外泌体的定量检测。因此，现有技术难以对外泌体进行大量、快速、精确地定性和定量分析。
技术实现思路
为解决现有技术中存在的问题，专利技术人在对CytoFLEXS流式细胞仪性能和参数设置进行充分研究的基础上，通过使用筛选的特异性蛋白表面标志物CD63进行标记，进而提供了一种流式细胞仪定量检测外泌体的方法。该方法可有效对血清、血浆和尿液等不同样品中的外泌体进行定量分析，检测结果特异性强，且操作过程方便、快捷，重复性好。为了实现本专利技术的目的，本专利技术采用以下技术方案。一种流式细胞仪检测外泌体的方法，包括如下具体步骤：(1)收集样品，提取外泌体；(2)抗体孵育：将提取的外泌体用含2％BSA的PBS溶液溶解，先后进行一抗和二抗孵育，得到CD63标记的外泌体检测液；(3)流式细胞仪的参数设置：正常运行流式细胞仪，进行参数设置；(4)上机检测：将所述CD63标记的外泌体检测液加入PBS溶液重悬，上机检测；(5)利用流式细胞仪分析软件对数据进行分析，得到外泌体的定量检测结果。需要说明的是，本专利技术的目的不是直接获得疾病诊断结果或健康状况，而只是获得外泌体的检测结果(中间结果)，利用本专利技术对外泌体进行准确定量后可以检测不同状态下外泌体含量的差异，通过设定相应的阈值可有望用于后续诊断工作，因此该专利技术及其相关的检测结果对后续的进一步诊断及信息介导等相关基础研究具有重要价值。优选地，所述样品为血清、血浆、尿液或细胞培养液，使用试剂盒进行外泌体的提取。收集血液样本，分离血清和血浆(分离血清时使用促凝管，分离血浆时使用抗凝管，分别室温3000rpm离心10min)；收集尿液样本时，使用离心管3000rpm离心10min后收集上清；收集细胞培养液时，3000rpm离心10min后收集上清。外泌体的提取，可使用现有的提取方法或试剂盒提取，优选使用LifeTechnologies(invitrogen)公司的试剂盒-TotalExosomeIsolationReagent，针对血清、血浆、尿液和细胞培养液的不同样品，试剂盒货号分别为：4478360、4484450、4484452、4478359。根据试剂盒说明书分别提取血清、血浆、尿液和细胞培养液中的外泌体，具体操作如下：取100uL血清、血浆、尿液或细胞培养液样品，2000g离心30min，以去除细胞碎片；将上清转移至新的离心管中，加入20uL(1/5样品体积)TotalExosomeIsolationReagent，在涡旋振荡器上充分混匀；将混匀后的样品在4℃冰箱孵育30min，孵育完成后，10000g室温离心10min，弃上清，底部沉淀即为外泌体。优选地，所述一抗和二抗孵育的步骤具体包括：1)一抗孵育：加入anti-CD63抗体，混匀，孵育25～35min；2)荧光二抗孵育：一抗孵育后加入荧光二抗，混匀，室温避光孵育25～35min。优选地，所述流式细胞仪为美国BeckmanCoulter公司的CytoFLEXS型号。优选地，所述参数设置的步骤具体包括：1)建立FSC/VSSC散点图，圈定500nm以下的微颗粒分布区域，设定门；2)建立CD63参数散点图，设定门。按正常程序打开流式细胞仪，建立FSC/VSSC散点图，使用美国BeckmanCoulter公司的Megamix-PlusFSCbeads，分别用100nm、200nm、300nm和500nm的微球，调整gain值，圈定500nm以下的微颗粒分布区域，设定门，同时以PBS溶液为阴参，去除PBS溶液中本身颗粒的干扰；同样的电压条件下，样本检测管分布于门内的包含囊泡微颗粒；建立CD63参数散点图，设定门，门内CD63阳性的囊泡微颗粒，即为外泌体。优选地，所述上机检测的上机速度设定为中速，使上机样品的机器读取速度为4000-8000个/秒。优选地，利用流式细胞仪分析软件CytExpert对数据进行分析，得到本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种流式细胞仪检测外泌体的方法，其特征在于：包括如下具体步骤：/n(1)收集样品，提取外泌体；/n(2)抗体孵育：将提取的外泌体用含2％BSA的PBS溶液溶解，先后进行一抗和二抗孵育，得到CD63标记的外泌体检测液；/n(3)流式细胞仪的参数设置：正常运行流式细胞仪，进行参数设置；/n(4)上机检测：将所述CD63标记的外泌体检测液加入PBS溶液重悬，上机检测；/n(5)利用流式细胞仪分析软件对数据进行分析，得到外泌体的定量检测结果。/n

【技术特征摘要】
1.一种流式细胞仪检测外泌体的方法，其特征在于：包括如下具体步骤：
(1)收集样品，提取外泌体；
(2)抗体孵育：将提取的外泌体用含2％BSA的PBS溶液溶解，先后进行一抗和二抗孵育，得到CD63标记的外泌体检测液；
(3)流式细胞仪的参数设置：正常运行流式细胞仪，进行参数设置；
(4)上机检测：将所述CD63标记的外泌体检测液加入PBS溶液重悬，上机检测；
(5)利用流式细胞仪分析软件对数据进行分析，得到外泌体的定量检测结果。


2.如权利要求1所述的流式细胞仪检测外泌体的方法，其特征在于：所述样品为血清、血浆、尿液或细胞培养液，使用试剂盒进行外泌体的提取。


3.如权利要求1所述的流式细胞仪检测外泌体的方法，其特征在于：所述一抗和二抗孵育的...

【专利技术属性】
技术研发人员：金芳芳，王延博，徐学博，陈张朋，薛姜飞，
申请(专利权)人：南京吉鹏博生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32