一种针对塔里木兔的个体识别方法技术

本发明专利技术涉及一种针对塔里木兔的个体识别方法，属于动物的测定和检验技术领域。本发明专利技术提出了通过STR片段检测及多样性分析所筛选出的12个可用于塔里木兔个体识别的STR位点及其引物序列，并提出对这12个STR位点进行扩增和毛细管电泳检测并分析，得到STR分型图谱。若两份样本在所检测的12个基因座存在不一致的STR分型图谱，可排除两份样本的同一性，当两份样本在所检测的12个基因座的STR分型完全一致时，需计算其个体识别的似然率；当似然率大于或等于1×10

An individual recognition method for Tarim rabbit

【技术实现步骤摘要】
一种针对塔里木兔的个体识别方法
本专利技术涉及一种针对塔里木兔的个体识别方法，属于动物的测定和检验

技术介绍
塔里木兔(Lepusyarkandensis)属兔形目(lagomorphs)兔科(leporidae)兔属(lepus)。英文名为Yarkandhares。其体形较小，毛色沙黄，体长为29—43cm，尾长6—11cm，体重1.2—1.6kg，耳朵较大，耳尖不呈黑色，体毛短而直。分布于新疆塔里木盆地，北起库尔勒、库车；南抵和田、且末；西止阿克苏、喀什，东达罗布洼地，几乎所有的县境内均有发现。塔里木兔是我国特有的一个物种，在世界范围内的分布仅限于新疆的塔里木盆地。但近几年来，由于人类大量捕杀，造成塔里木兔数量急剧下降，1989年被列为国家二级重点保护动物。前人对塔里木兔的研究主要是对其地理分布等资源现状进行分析或利用线粒体DNA(mtDNA)上的部分基因片段，如控制区(D-loop)、细胞色素b(Cytb)基因进行种群遗传多样性分析。迄今，还没有利用核DNA上的STR(shorttandemrepeat，短片段重复序列)多态性对塔里木兔进行遗传多样性分析的报道。STR广泛存在于人类及哺乳动物的基因组中，具有高度多态性，它们一般由2-6个碱基构成一个核心序列，核心序列串联重复排列，由核心序列重复数目的变化产生长度多态性。对于一个特定的个体，染色体上某个特定位置的重复序列的重复次数是固定的，而对于不同的个体在同一位置处的重复次数可能不同，这就构成了群体中这些重复序列的多态性。由于人类及哺乳动物基因组中这种重复序列非常多，通过对这种多态性的检测，就可以明确区分个体与个体的不同，确定父母子的亲缘关系，区分不同个体的方法叫做“个体识别”，也被称为“同一认定”。在偷猎、运输、贩卖、食用塔里木兔的野生动物案件中往往只能获得塔里木兔的肢体、毛皮，在某些案件现场甚至只能获得少量血痕、毛发，对塔里木兔的个体识别方法的研发将有助于识别案件中的不同肢体、尸块、皮毛、血痕或毛发样本来自几只塔里木兔。作为国家二级重点保护动物，涉案塔里木兔的个体数量将直接影响量刑，如涉案塔里木兔的个数达到20只及以上即属于非法狩猎“情节严重”的刑事案件。因此，对塔里木兔个体识别方法的研发将解决目前无法识别不同检材是否来自不同个体的问题。而本专利技术能够很好地解决上述的问题。
技术实现思路
针对上述现有技术的缺陷，本专利技术目的在于提出一套可用于塔里木兔个体识别的引物序列，并提出一种针对塔里木兔的个体识别方法，该方法利用STR片段检测及多样性分析所筛选出的12个可用于塔里木兔个体识别的STR位点，并对这12个STR位点进行扩增和毛细管电泳检测，通过分析毛细管电泳检测得到的分型数据和计算个体识别的证据强度，来进行塔里木兔的个体识别。该方法可以有效解决对偷猎塔里木兔案件的准确量刑问题。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下所述：一种针对塔里木兔的个体识别方法，包括如下步骤：(一)筛选用于个体识别的STR位点：通过STR片段检测及多样性分析筛选出12个可用于塔里木兔个体识别的STR位点，扩增这12个STR位点的引物序列如表1所示。其中，这12个STR位点遗传学数据如表2、表3所示。表1扩增塔里木兔STR位点所用引物序列表2塔里木兔12个STR位点等位基因频率分布表(群体样本量n＝60)表3塔里木兔12个STR位点各遗传参数统计结果LocusNaNeIPICHoHePVJM31153.86011.81310.71400.67440.7497PVJM5873.23261.4910.65890.43240.7001PVJM6483.33531.55640.67350.4390.7088PVJM74167.32372.33330.85130.73330.8732PVJM2112.48951.45750.57980.31250.6046PVJM76177.47562.32670.85430.53570.874PVJM42116.17222.07690.82060.5510.8466PVJM542.40951.03780.51620.60710.5903PVJM89135.32122.01810.79450.38890.8197PVJM11156.13592.1030.81800.74550.8447PVJM4694.38251.66010.73720.28850.7793PVJM9351.47650.66470.30000.17860.3256Mean10.91674.46791.71160.69320.27360.7264St.Dev4.37881.99780.50860.15920.1592注：Na:观测等位基因，Ne:有效等位基因，I：香农指数，PIC：多态信息指数，Ho：观测杂合度，He：期望杂合度(二)检测样本DNA的提取：针对塔里木兔的不同状态的样本采用不同的取样方法。肌肉组织剪取约10mg～30mg置于EP管中，骨骼磨取约20mg～30mg骨粉置EP管中，皮毛剪取皮部分(若只有毛发则剪取毛发的毛囊部分)约10mg～30mg置于EP管中、血痕剪取适量置EP管中。样本的基因组总DNA均用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取，提取方法参照试剂盒说明书，骨骼、毛发组织消化时间延长为20～30h。用分光光度法检测样本DNA的纯度和浓度。将提取到的样品总DNA置于-20℃～-70℃保存，待后续试验用。(三)STR复合扩增分别将需要进行同一认定(个体识别)的样本DNA作为模板DNA，选取表1中的各STR位点引物分别扩增各STR位点，得到STR扩增产物。(1)PCR扩增体系配方为下述两种配方中的任意一种：配方一：本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种针对塔里木兔的个体识别方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：/n(一)扩增针对塔里木兔个体识别的STR位点：利用STR片段检测及多样性分析筛选出的12个可用于塔里木兔个体识别的STR位点及扩增这12个STR位点的引物序列如表1所示；/n表1 扩增塔里木兔STR位点所用引物序列/n

【技术特征摘要】
1.一种针对塔里木兔的个体识别方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(一)扩增针对塔里木兔个体识别的STR位点：利用STR片段检测及多样性分析筛选出的12个可用于塔里木兔个体识别的STR位点及扩增这12个STR位点的引物序列如表1所示；
表1扩增塔里木兔STR位点所用引物序列



(二)检测样本DNA的提取：针对塔里木兔的不同状态的样本采用不同的取样方法；
(三)STR扩增：分别将需要进行个体识别的样本DNA作为模板DNA，选取表1中的各STR位点引物分别扩增各STR位点，得到STR扩增产物：
其中，PCR扩增体系配方为下述两种配方中的任意一种：
配方一：






配方二：



PCR扩增条件为：首先在98℃保温2min，然后进行30个保温循环，所述保温循环为在98℃保温10s、在60℃保温10s、在72℃保温10s，最后在72℃保温5min，保温结束后将样品置于4℃保存；
(四)扩增产物的毛细管电泳检测；
(五)同一认定的统计学计算：当两份样本在所检测的12个基因座的STR分型图谱完全一致时，需计算其个体识别的证据强度，即似然率；
(六)个体识别的认定：似然率大于或等于1×1012时可认定两份样本的同一性；若两份样本在所检测的12个基因座存在不一致的STR分型图谱，可排除两份样本的同一性。


2.根据权利要求1所述的塔里木兔的个体识别方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄娅琳，陈云霞，邱云亮，徐燕红，郭海涛，蒋敬，周用武，费宜玲，
申请(专利权)人：南京森林警察学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32