一种慢病毒载体介导SV40 T抗原转染获得永生化细胞株的方法技术

本发明专利技术公开了一种慢病毒载体介导SV40 T抗原转染获得永生化细胞株的方法，属于细胞生物学领域。具体地，本发明专利技术通过构建一种能够高效、快速转染的SV40 T抗原慢病毒表达载体，该载体通过工程细胞包装可获得表达SV40 T抗原的慢病毒颗粒用于转染原代分离细胞，进而通过博来霉素（zeocin）抗性特点筛选获得永生化细胞株。本发明专利技术公开的构建永生化细胞株的方法具有高效、方便、快捷的特点，并且价格低廉，适于推广应用。

【技术实现步骤摘要】
一种慢病毒载体介导SV40T抗原转染获得永生化细胞株的方法
本专利技术属于细胞生物学领域，具体地，涉及一种慢病毒载体介导SV40T抗原转染获得永生化细胞株的方法。
技术介绍
细胞生物学研究中多数原代分离细胞作为终末分化的细胞在体外的培养和传代时间有限，传代一定次数后就会进入衰老期而不能再继续增殖。而反复分离原代细胞不仅费时费力，而且各批次细胞间存在差异，不能保持细胞生理指标的稳定性。一些抑癌基因P53和pRB的失活以及端粒酶的激活，是人体细胞获得永生化的必要条件。哺乳动物细胞使用几种方法诱导细胞永生化(Cellimmortalizing)，其中包括使用猿猴病毒40(Simianvirus40，SV40)T抗原基因、人类端粒酶逆转录酶基因、P53和pRB的shRNAs等。SV40大T抗原是由SV40病毒早期编码区编码的一种多功能磷酸蛋白，在病毒复制过程中发挥着重要作用。SV40大T抗原具有活化宿主细胞核糖体基因、诱导DNA合成、修饰蛋白质合成起始因子等作用，并且能结合、调控某些关键性的细胞调控蛋白，如视网膜母细胞瘤蛋白家族成员(如本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种构建永生化细胞株的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)构建SV-40T抗原慢病毒表达载体：/n以含SV40 T抗原cDNA序列的SV40 tsA58质粒为模板，根据NCBI的SV40完整基因组(NC_001669.1)设计特定的质粒构建引物，高保真PCR获取SV40T抗原全长cDNA，对扩增得到PCR产物进行纯化；/n将PCR产物TOPO克隆进入pENTR

【技术特征摘要】
1.一种构建永生化细胞株的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)构建SV-40T抗原慢病毒表达载体：
以含SV40T抗原cDNA序列的SV40tsA58质粒为模板，根据NCBI的SV40完整基因组(NC_001669.1)设计特定的质粒构建引物，高保真PCR获取SV40T抗原全长cDNA，对扩增得到PCR产物进行纯化；
将PCR产物TOPO克隆进入pENTRTMTOPO载体，获得pENTR-SV40T质粒；
LR重组反应将pENTR-SV40T质粒中的SV40T抗原cDNA克隆到目标慢病毒载体，构建SV40T抗原慢病毒表达载体pLenti4/V5-GW/SV40T，
2)慢病毒包装：
采用脂质体LipofectamineTM2000介导pLenti4/V5-SV40T和包装质粒pCMV-VSV-G及psPAX2转染工程细胞293FT，进行假病毒包装，
3)慢病毒介导SV40T抗原转染原代分离细胞获得永生化细胞株：
分离和原代培养待永生化细胞，用含SV40T抗原的轮替病毒培养上清液转染原代培养细胞，以博来霉素抗性特点筛选转染和稳定表达SV40T抗原的原代培养细胞，获得永生化细胞株。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述构建引物包括具有SEQIDNo.1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQIDNo.2所示核苷酸序列的下游引物。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中高保真PCR的体系为：引物混合液1.5μL，10×PfuDNA聚合酶反应混合物(含dNTPs)5μL，PfuDNA聚合酶0.5μL，模板DNA质粒1μL，用灭菌去离子水补齐到50...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭津生，王满，
申请(专利权)人：郭津生，
类型：发明
国别省市：上海;31