一种柱色谱-高速逆流色谱法从羊脆木根皮中纯化羊脆木素A的方法技术

本发明专利技术公开了一种柱色谱‑高速逆流色谱法从羊脆木根皮中纯化羊脆木素A的方法，包括如下步骤：步骤A、取适量羊脆木根皮粉末，用乙醇水溶液热回流提取，提取液过滤，浓缩至无醇味，乙酸乙酯等体积萃取，乙酸乙酯部分减压浓缩得乙酸乙酯萃取物；步骤B、取乙酸乙酯萃取物加适量乙醇水溶液溶解，脱脂棉过滤，上样于D101大孔吸附树脂柱，先用10倍柱体积的体积百分浓度为30％的乙醇水溶液洗脱除杂，再用体积百分浓度为65％的乙醇水溶液洗脱，收集第6个柱体积的洗脱液，减压回收乙醇后冷冻干燥得到羊脆木素A富集物；步骤C、高速逆流色谱纯化羊脆木素A。本发明专利技术提供了的方法不依赖于硅胶柱层析和凝胶柱层析，易于操作和工业化应用。

【技术实现步骤摘要】
一种柱色谱-高速逆流色谱法从羊脆木根皮中纯化羊脆木素A的方法
本专利技术属于化学领域，涉及天然化合物的制备方法，具体涉及一种柱色谱-高速逆流色谱法从羊脆木根皮中纯化羊脆木素A的方法。
技术介绍
羊脆木PittosporumkerriiCraib为海桐花属PittosporumBank植物，其根、茎、皮作为民间草药使用已有数千年的历史。有报道从羊脆木的根、茎、皮等部位的提取物中陆续分离出多种化学成分，按结构类型主要有三萜及其苷、倍半萜、类胡萝卜素、甾醇等化合物。这些化学成分具有多种生物活性，如抗肿瘤、抗炎镇痛、抗病毒和抗微生物等药理活性。羊脆木素A即为一种从羊脆木根皮中分离得到的异苯并呋喃内脂化合物(化学结构如下)，其对多种肿瘤细胞具有细胞毒活性，对NB4、SH-SY5Y、PC3、A549和MCF-7细胞的IC50值分别为3.6、5.2、8.8、5.7和6.0μmol/L(文献：羊脆木根皮中1个新的异苯并呋喃内脂类化合物及其细胞毒活性，中草药，第47卷第23期2016年12月)。目前，羊脆木素A的制备方法研究较少。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种柱色谱-高速逆流色谱法从羊脆木根皮中纯化羊脆木素A的方法。本专利技术目的通过以下方案实现：一种柱色谱-高速逆流色谱法从羊脆木根皮中纯化羊脆木素A的方法，包括如下步骤：步骤A、总提取物提取和乙酸乙酯萃取取适量羊脆木根皮粉末，用乙醇水溶液热回流提取，提取液过滤，浓缩至无醇味，乙酸乙酯等体积萃取，乙酸乙酯部分减压浓缩得乙酸乙酯萃取物；步骤B、柱色谱富集羊脆木素A取乙酸乙酯萃取物加适量乙醇水溶液溶解，脱脂棉过滤，上样于D101大孔吸附树脂柱(柱床高度50cm，柱床直径10cm)，先用10倍柱体积的体积百分浓度为30％的乙醇水溶液洗脱除杂，再用体积百分浓度为65％的乙醇水溶液洗脱，收集第6个柱体积的洗脱液，减压回收乙醇后冷冻干燥得到羊脆木素A富集物；步骤C、高速逆流色谱纯化羊脆木素A以二氯甲烷:乙酸乙酯:乙醇:水(7:5:6:5，V/V)为溶剂体系，上相为固定相，下相为流动相，以等体积上相和下相为样品溶解溶剂；设定水浴温度为30℃，温度稳定后，将固定相泵满色谱柱，打开主机，调节转速为850r/min，洗脱模式为反接正转，转速稳定后以3mL/min的流速泵入流动相，待色谱柱末端有流动相流出时继续泵入适量流动相使体系充分平衡；将羊脆木素A富集物用样品溶解溶剂配制成样品溶液，取适量从进样环注入管路，开启色谱工作站的采集按钮，检测波长272nm，根据色谱图收集羊脆木素A对应的色谱峰，浓缩干燥。优选地，步骤A中，羊脆木根皮粉末用体积百分浓度为70～80％的乙醇水溶液热回流提取。优选地，热回流提取的料液比为1:5。优选地，热回流提取3次，每次2h。优选地，步骤A中，乙酸乙酯等体积萃取3次。优选地，步骤B中，取乙酸乙酯萃取物加适量体积百分浓度为15％的乙醇水溶液溶解。优选地，步骤C中，将固定相以30mL/min的流速泵满色谱柱。优选地，步骤C中，待色谱柱末端有流动相流出时继续泵入20min流动相使体系充分平衡。优选地，步骤C中，将羊脆木素A富集物用样品溶解溶剂配制成浓度为10mg/mL的样品溶液，取10mL样品溶液从进样环注入管路。有益效果：本专利技术提供了一种柱色谱-高速逆流色谱法从羊脆木根皮中纯化羊脆木素A的方法，不依赖于硅胶柱层析和凝胶柱层析，易于操作和工业化应用。附图说明图1为羊脆木素A富集物与羊脆木素A对照品的HPLC色谱图比对；图2为高速逆流色谱分离色谱图；图3为高速逆流色谱纯化产物与羊脆木素A对照品的HPLC色谱图比对。具体实施方式实施例1：羊脆木素A的制备一、实验材料干燥的羊脆木根皮购自中药材市场，粉碎过40目筛，阴凉处保存备用。乙醇为工业无水乙醇，根据需要加水制成不同体积百分浓度的乙醇水溶液。二氯甲烷和乙酸乙酯为化学纯，为南京化学试剂股份有限公司产品。羊脆木素A对照品由云南民族大学馈赠，纯度≥98％。C18色谱柱为安捷伦公司产品，型号为AgilentTC-C18，规格为250mm×4.6mm、5μm。色谱纯乙腈、三氟乙酸为TEDIA公司产品。水为色谱用水，采用制水机自制。二、实验方法和结果1、HPLC分析条件色谱柱为AgilentTC-C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；柱温25℃；流动相为乙腈(A)-0.05％三氟乙酸水(B)，梯度洗脱(0～5min，25％A；5～35min，25％～75％A；35～40min，75％～100％A)；流动相流速1mL/min；检测波长272nm；进样量10μL。2、总提取物提取和乙酸乙酯萃取取5kg羊脆木根皮粉末，用体积百分浓度为75％的乙醇水溶液按照料液比1:5(1kg:5L)热回流提取3次，每次2h，合并提取液，过滤，浓缩至无醇味，乙酸乙酯等体积萃取3次，合并乙酸乙酯部分，减压浓缩得乙酸乙酯萃取物。3、柱色谱富集羊脆木素A取乙酸乙酯萃取物250g加体积百分浓度为15％的乙醇水溶液溶解，脱脂棉过滤，上样于D101大孔吸附树脂柱(柱床高度50cm，柱床直径10cm)，先用10倍柱体积的体积百分浓度为30％的乙醇水溶液洗脱除杂，再用体积百分浓度为65％的乙醇水溶液洗脱，收集第6个柱体积的洗脱液，减压回收乙醇后冷冻干燥得到羊脆木素A富集物(HPLC图见图1)。4、高速逆流色谱纯化羊脆木素A以二氯甲烷:乙酸乙酯:乙醇:水(7:5:6:5，V/V)为溶剂体系，上相为固定相，下相为流动相，以等体积上相和下相为样品溶解溶剂。设定水浴温度为30℃，温度稳定后，将固定相以30mL/min的流速泵满色谱柱，打开主机，调节转速为850r/min，洗脱模式为反接正转，转速稳定后以3mL/min的流速泵入流动相，待色谱柱末端有流动相流出时继续泵入20min流动相使体系充分平衡。将羊脆木素A富集物用样品溶解溶剂配制成浓度为10mg/mL的样品溶液，取10mL样品溶液从进样环注入管路，开启色谱工作站的采集按钮，检测波长272nm，根据色谱图(图2)收集羊脆木素A对应的色谱峰(即120～140min)，浓缩干燥。纯化产物的HPLC图见图3，与羊脆木素A对照品具有相同的HPLC保留时间，HPLC归一化纯度为98.2％。13C-NMR(125MHz,C5D5N):δ126.2(C-1,s),159.3(C-2,s),111.3(C-3,d),144.8(C-4,s),116.6(C-5,s),130.4(C-6,d),27.3(C-7,t),124.4(C-8,d),133.4(C-9,s),17.7(C-10,q),25.8(C-11,q),69.0(C-1’,t),168.8(C-2’,s).HR-ESI-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种柱色谱-高速逆流色谱法从羊脆木根皮中纯化羊脆木素A的方法，其特征在于，包括如下步骤：/n步骤A、总提取物提取和乙酸乙酯萃取/n取适量羊脆木根皮粉末，用乙醇水溶液热回流提取，提取液过滤，浓缩至无醇味，乙酸乙酯等体积萃取，乙酸乙酯部分减压浓缩得乙酸乙酯萃取物；/n步骤B、柱色谱富集羊脆木素A/n取乙酸乙酯萃取物加适量乙醇水溶液溶解，脱脂棉过滤，上样于D101大孔吸附树脂柱(柱床高度50cm，柱床直径10cm)，先用10倍柱体积的体积百分浓度为30％的乙醇水溶液洗脱除杂，再用体积百分浓度为65％的乙醇水溶液洗脱，收集第6个柱体积的洗脱液，减压回收乙醇后冷冻干燥得到羊脆木素A富集物；/n步骤C、高速逆流色谱纯化羊脆木素A/n以二氯甲烷:乙酸乙酯:乙醇:水(7:5:6:5，V/V)为溶剂体系，上相为固定相，下相为流动相，以等体积上相和下相为样品溶解溶剂；设定水浴温度为30℃，温度稳定后，将固定相泵满色谱柱，打开主机，调节转速为850r/min，洗脱模式为反接正转，转速稳定后以3mL/min的流速泵入流动相，待色谱柱末端有流动相流出时继续泵入适量流动相使体系充分平衡；将羊脆木素A富集物用样品溶解溶剂配制成样品溶液，取适量从进样环注入管路，开启色谱工作站的采集按钮，检测波长272nm，根据色谱图收集羊脆木素A对应的色谱峰，浓缩干燥。/n...

【技术特征摘要】
1.一种柱色谱-高速逆流色谱法从羊脆木根皮中纯化羊脆木素A的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤A、总提取物提取和乙酸乙酯萃取
取适量羊脆木根皮粉末，用乙醇水溶液热回流提取，提取液过滤，浓缩至无醇味，乙酸乙酯等体积萃取，乙酸乙酯部分减压浓缩得乙酸乙酯萃取物；
步骤B、柱色谱富集羊脆木素A
取乙酸乙酯萃取物加适量乙醇水溶液溶解，脱脂棉过滤，上样于D101大孔吸附树脂柱(柱床高度50cm，柱床直径10cm)，先用10倍柱体积的体积百分浓度为30％的乙醇水溶液洗脱除杂，再用体积百分浓度为65％的乙醇水溶液洗脱，收集第6个柱体积的洗脱液，减压回收乙醇后冷冻干燥得到羊脆木素A富集物；
步骤C、高速逆流色谱纯化羊脆木素A
以二氯甲烷:乙酸乙酯:乙醇:水(7:5:6:5，V/V)为溶剂体系，上相为固定相，下相为流动相，以等体积上相和下相为样品溶解溶剂；设定水浴温度为30℃，温度稳定后，将固定相泵满色谱柱，打开主机，调节转速为850r/min，洗脱模式为反接正转，转速稳定后以3mL/min的流速泵入流动相，待色谱柱末端有流动相流出时继续泵入适量流动相使体系充分平衡；将羊脆木素A富集物用样品溶解溶剂配制成样品溶液，取适量从进样环注入管路，开启色谱工作站...

【专利技术属性】
技术研发人员：周天北，
申请(专利权)人：南京乐扬医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32