TSLP在制备治疗腰椎间盘突出药物中的应用制造技术

本发明专利技术公开了TSLP在制备治疗腰椎间盘突出药物中的应用。TSLP可以通过诱导单核细胞趋化因子‑1(monoeyte chemotactic protein‑1,MCP‑1)的表达升高来促进巨噬细胞向椎间盘组织浸润，进而促进突出腰椎间盘组织的重吸收过程。

【技术实现步骤摘要】
TSLP在制备治疗腰椎间盘突出药物中的应用
本专利技术涉及医学研究领域，具体的涉及TSLP在制备治疗腰椎间盘突出药物中的应用。
技术介绍
腰椎间盘突出是指腰椎间盘退行性改变或外伤所致纤维破裂造成髓核从椎间盘破裂脱出，压迫腰椎神经，从而出现要退放射性疼痛，此称为腰椎间盘突出症。目前，只有少数脱出型椎间盘突出症及经保守治疗症状未缓解的腰椎间盘突出症患者接受手术治疗。俞振翰等研究表明，突出的椎间盘组织可通过重吸收过程达到自愈，但其潜在机制仍未明确。王志伟和元虎提出，巨噬细胞浸润参与重吸收的过程，可以使突出的椎间盘组织明显缩小。这可能与巨噬细胞直接或间接介导的一些因子释放有关，包括基质金属蛋白酶(mmatrixmetalloproteinases,MMPs)和血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)。胸腺基质淋巴细胞生成素(thymicstromallym-phopoietin，TSLP)是1994年由Friend等在小鼠胸腺基质细胞的上清液中发现的IL-7样细胞因子，主要由非造血细胞分泌，如纤维母细胞、上皮细胞和基质细胞等。TSLPmRNA主要在胸腺、肺、皮肤、小肠等组织的上皮细胞及基质细胞和肥大细胞中表达，并与哮喘、气道变态炎性反应密切相关。Moret等发现，TSLP在风湿关节炎中扮演重要角色；Koyama等在对类风湿关节炎和骨关节炎患者滑膜成纤维细胞的体外实验研究中证实了TSLP的表达增加，说明在骨组织中也有TSLP的表达，并且参与炎症反应。Ohba等研究证实，在小鼠及人类的椎间盘组织中同样有TSLP的表达，并且在体外实验中证实肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α，TNF-α)可通过核因子-κB(nuclearfactor-κB，NF-κB)上调TSLP的表达，而TSLP可通过促使单核细胞趋化因子-1(monocytechemotacticprotein-1，MCP-1)的表达增加而引起巨噬细胞向椎间盘组织浸润，同时作者在椎间盘突出患者的椎间盘组织中也发现了TSLP表达增加，认为TSLP为介导重吸收的重要因子。然而，椎间盘突出后，机体是否上调了TSLP的表达、如何调控TSLP，目前我们仍不知道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供TSLP在制备治疗腰椎间盘突出药物中的应用。申请人在前期研究时发现，使用炎症因子TNF-α刺激鼠椎间盘组织模拟腰椎间盘突出症的炎性环境时，通过ELISA法观测到与对照组相比，实验组培养上清液中TSLP和MCP-1升高。申请人由此假设：TSLP的高表达可促进重吸收过程。本专利技术研究了TSLP的表达对腰椎间盘组织重吸收的作用，提供了TSLP在制备治疗腰椎间盘突出药物中的应用。进一步的，TSLP的高表达可促进突出腰椎间盘组织的重吸收。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本专利技术提供了TSLP的高表达可促进突出腰椎间盘组织的重吸收。在制备治疗腰椎间盘突出药物中的应用，为今后研究腰椎间盘突出的病理生理过程提供新的分子理论基础，并为寻求最佳抗炎时机及今后利用机体自生修复机制保守治疗腰椎间盘突出提供新的靶点。附图说明图1是大鼠髓核细胞培养图，2x为2倍放大，4x为4倍放大。图2是免疫荧光检测鉴定髓核细胞图，其中A为CollagenII染色(200倍)，B为细胞核染色(200倍)，C为CollagenII染色(400倍)，D为细胞核染色(400倍)。图3是免疫组化法检测组织中NF-κB磷酸化水平图，细胞核染色为棕黄色或棕褐色为阳性，ABC法x40，A为对照组，B为TNF-α组，C为TGF-β组，D为TGF-β抑制剂组(HTS组)。图4是使用10ng/mlTNF-α、10ng/mlTGF-β、1uMHTS(TGF-β通路抑制剂)培养鼠椎间盘组织0、3、6、12、24h后，免疫印迹法(Western-blot)检测p-NFκB蛋白表达情况。图5是IL-6、JAK/STAT抑制剂(BP-1-102)作用下使用qRT-PCR技术检测各基因表达情况图。A为IL-6(10ng/ml)刺激下，JAK1、STAT3、TSLPmRNA的表达情况；B为JAK/STAT抑制剂(BP-1-102,500nM)作用下STAT3、TSLPmRNA的表达情况。(*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001)图6是IL-6、JAK/STAT抑制剂(BP-1-102)作用下使用Western-blot技术检测TSLP蛋白的表达情况图。图7是IL-6、TGF-β/SMAD通路抑制剂、JAK/STAT通路抑制剂作用72h后细胞培养上清液中TGF-β的表达情况图。(*表示P<0.05)具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本专利技术技术方案做进一步详细描述：一、主要材料及试剂DMEM/F12、胰蛋白酶、胎牛血清(Gibico，USA)；Trizol(Ambion,USA)；反转录试剂盒(Termo,USA)qPCR试剂盒(KAPA,瑞士)；II型胶原酶(Biofoxx,瑞典)；鼠抗-Smad2、兔抗-Smad7、鼠抗-p-STAT3、兔抗-TSLP、HRP标记的二抗(上海生工生物工程有限公司，上海，中国)；培养瓶、培养板(NEST，Thermo，USA)。二、大鼠髓核细胞的分离及培养4周龄雌性SD大鼠(由西安交通大学动物实验中心提供)腹腔过量注射麻醉剂处死，75％乙醇浸泡10min。无菌实验台上延背部分离脊柱，剥离脊柱周围附着组织，无菌PBS冲洗3次，显微镜下分离椎间盘(保留上下终板)，切开纤维环，小心收集胶冻状髓核组织至1.5ml离心管，将收集好的的髓核组织先后使用有抗生素和无抗菌素的PBS液清洗髓核组织3遍，1500rpm，离心5min，弃上清；加入0.25％胰酶37℃消化30min，每15min摇晃一次，使用含血清的DMEM终止消化后1000rpm离心5min，弃上清；使用含0.2％II型胶原酶的DMEM/F12(20％FPS、双抗)培养基重悬，37℃静置消化4h，每隔1h摇晃一次，待絮状组织消失后用70um细胞滤网过滤，滤过液900rpm，离心5min，弃上清；DMEM/F12(20％FPS、双抗)重悬，接种于25cm2透气培养瓶中，置于37℃、饱和湿度、体积分数5％的CO2培养箱中。5天后第一换液，以后每2天换液一次。于显微镜下观察细胞贴壁及生长情况，如图1所示。大鼠髓核细胞附壁生长融合率达到80％时将细胞进行传代培养。PBS液清洗两次,弃上清液，0.25％胰蛋白酶消化细胞。显微镜下观察，消化1-2min，可看到细胞相互分离变圆，即消化完成。快速弃去胰酶，加入完全培养基，吹打细胞，制成单细胞悬液，按1:4的比例传代，37℃、5％CO2饱和湿度条件下扩大培养，取第二、三代大鼠髓核细胞进行后续试验。三、免疫荧光标记鉴定髓核细胞将培养好的对数生长期的大鼠髓核细胞用0.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.TSLP在制备治疗腰椎间盘突出药物中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.TSLP在制备治疗腰椎间盘突出药物中的应用。


2.根据权利要求1所述的TS...

【专利技术属性】
技术研发人员：祝勇，杨学军，达逸峰，黄智，王文磊，李莉，
申请(专利权)人：内蒙古医科大学第二附属医院，
类型：发明
国别省市：内蒙;15