百日咳毒素产品和百白破疫苗中活性蛋白的测定方法技术

本发明专利技术公开了一种百日咳毒素产品和百白破疫苗中活性蛋白的定性、定量测定方法。采用高效液相色谱串联质谱方法，建立了一种高通量、高选择性、高灵敏度的百日咳毒素产品和百白破疫苗活性蛋白百日咳毒素、丝状血凝素、黏附素、菌毛蛋白和腺苷酸环化酶毒素的定量方法。本方法首次从复杂的疫苗基质中筛查出可用于各活性疫苗蛋白定性和定量分析的特征肽段，这些肽段与其它所报道的蛋白肽段不同，不能通过蛋白检索库获得，也不能通过这些疫苗蛋白的氨基酸序列简单得出。可实现不同生产厂家、不同批次百日咳毒素产品和百白破疫苗中百日咳毒素5种亚基、丝状血凝素、黏附素、菌毛蛋白和腺苷酸环化酶毒素的同时定量。

Determination of active protein in pertussis toxin products and pertussis vaccine

【技术实现步骤摘要】
百日咳毒素产品和百白破疫苗中活性蛋白的测定方法
本专利技术具体涉及一种百日咳毒素产品和百白破疫苗中活性蛋白百日咳毒素(PT)五种亚基(S1-S5)、丝状血凝素(FAH)、黏附素(PRN)、菌毛蛋白(FIM)和腺苷酸环化酶毒素(ACT)的定性、定量测定方法。本专利技术属于疫苗质量评价

技术介绍
百日咳是一种由百日咳杆菌引起的急性呼吸道传染病，其临床特征为咳嗽逐渐加重，呈典型的阵发性、痉挛性咳嗽，咳嗽并伴随出现深长的鸡啼样吸气性吼声，病程长达2～3个月，故有百日咳之称。为了预防百日咳疾病，中国和世界卫生组织先后发展了百日咳毒素产品和百日咳-破伤风-白喉(百白破)联合疫苗。自从广泛实施免疫接种后，本病的发生率已大幅度减少。无论是百日咳毒素产品还是百白破疫苗，百日咳毒素(PT,pertussistoxin)、丝状血凝素(FAH，Filamentoushemagglutinin)、黏附素(PRN，pertactin)、菌毛蛋白(FIM，fimbrial)和腺苷酸环化酶毒素(adenylatecyclasetoxin，ACT)均为其中的主要活性蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.百日咳毒素产品中百日咳毒素5种亚基的定性鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)取百日咳毒素产品进行酶解前处理，得到酶解液；/n(2)将百日咳毒素标准品溶液和步骤(1)所得酶解液分别进行高效液相色谱串联质谱检测，通过离子对质核比及特征肽段的保留时间进行定性鉴别；/n百日咳毒素S1亚基特征肽段为：SCQVGSSNSAFVSTSSSR、ILAGALATYQSEYLAHR、ANPNPYTSR、SVASIVGTLVR；/n百日咳毒素S2亚基特征肽段为：GSGDLQEYLR、NTGQPATDHYYSNVTATR、LLSSTNSR、DGTPGGAFDLK；/n百日咳毒素S3亚基特征肽段为：DAP...

【技术特征摘要】
1.百日咳毒素产品中百日咳毒素5种亚基的定性鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取百日咳毒素产品进行酶解前处理，得到酶解液；
(2)将百日咳毒素标准品溶液和步骤(1)所得酶解液分别进行高效液相色谱串联质谱检测，通过离子对质核比及特征肽段的保留时间进行定性鉴别；
百日咳毒素S1亚基特征肽段为：SCQVGSSNSAFVSTSSSR、ILAGALATYQSEYLAHR、ANPNPYTSR、SVASIVGTLVR；
百日咳毒素S2亚基特征肽段为：GSGDLQEYLR、NTGQPATDHYYSNVTATR、LLSSTNSR、DGTPGGAFDLK；
百日咳毒素S3亚基特征肽段为：DAPPGAGFIYR、TGQPAADHYYSK、LLASTNSR、GNAELQTYLR；
百日咳毒素S4亚基特征肽段为：LGAAASSPDAHVPFCFGK、QLTFEGKPALELIR、AVFMQQRPLR、RPGSSPMEVMLR；
百日咳毒素S5亚基特征肽段为：IYSPADVAGLPTHLYK、IYSPADVAGLPTHLYK、NFTVQELALK。


2.百日咳毒素产品中百日咳毒素5种亚基的定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取百日咳毒素产品进行酶解前处理，得到酶解液，将酶解液定容得到待测液；
(2)将步骤(1)所得酶解液进行高效液相色谱串联质谱检测，根据百日咳毒素各亚基特征肽段的色谱峰面积和标准工作曲线得到待测液中百日咳毒素各亚基的含量，通过待测液体积与百日咳毒素产品体积的换算，得到百日咳毒素产品中各亚基的含量；所述各亚基特征肽段的色谱峰面积为任意三条及以上特征肽段的色谱峰面积之和；
百日咳毒素S1亚基特征肽段为：SCQVGSSNSAFVSTSSSR、ILAGALATYQSEYLAHR、ANPNPYTSR、SVASIVGTLVR；
百日咳毒素S2亚基特征肽段为：GSGDLQEYLR、NTGQPATDHYYSNVTATR、LLSSTNSR、DGTPGGAFDLK；
百日咳毒素S3亚基特征肽段为：DAPPGAGFIYR、TGQPAADHYYSK、LLASTNSR、GNAELQTYLR；
百日咳毒素S4亚基特征肽段为：LGAAASSPDAHVPFCFGK、QLTFEGKPALELIR、AVFMQQRPLR、RPGSSPMEVMLR；
百日咳毒素S5亚基特征肽段为：IYSPADVAGLPTHLYK、IYSPADVAGLPTHLYK、NFTVQELALK。


3.百白破疫苗中百日咳毒素5种亚基的定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取百白破疫苗进行酶解前处理，得到酶解液，将酶解液定容得到待测液；
(2)将步骤(1)所得酶解液进行高效液相色谱串联质谱检测，根据百日咳毒素各亚基特征肽段的色谱峰面积和标准工作曲线得到待测液中百日咳毒素各亚基的含量，通过待测液体积与百白破疫苗体积的换算，得到百白破疫苗中各亚基的含量；所述各亚基特征肽段的色谱峰面积为任意三及以上特征肽段的色谱峰面积之和；
百日咳毒素S1亚基特征肽段为：SCQVGSSNSAFVSTSSSR、ILAGALATYQSEYLAHR、ANPNPYTSR、SVASIVGTLVR；
百日咳毒素S2亚基特征肽段为：GSGDLQEYLR、NTGQPATDHYYSNVTATR、LLSSTNSR、DGTPGGAFDLK；
百日咳毒素S3亚基特征肽段为：DAPPGAGFIYR、TGQPAADHYYSK、LLASTNSR、GNAELQTYLR；
百日咳毒素S4亚基特征肽段为：LGAAASSPDAHVPFCFGK、QLTFEGKPALELIR、AVFMQQRPLR、RPGSSPMEVMLR；
百日咳毒素S5亚基特征肽段为：IYSPADVAGLPTHLYK、IYSPADVAGLPTHLYK、NFTVQELALK。


4.百白破疫苗中丝状血凝素的定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取百白破疫苗进行酶解前处理，得到酶解液，将酶解液定容得到待测液；
(2)将步骤(1)所得酶解液进行高效液相色谱串联质谱检测，根据丝状血凝素特征肽段的色谱峰面积和标准工作曲线得到待测液中丝状血凝素的含量，通过待测液体积与百日咳疫苗体积的换算，得到百白破疫苗中丝状血凝素的含量；
丝状血凝素的特征肽段为：ATPIAAGAR、LTAAVALLNK、AALIEAGGNAR、TPLPVSLTALDNR；
所述色谱峰面积为任意三条及以上丝状血凝素的特征肽段峰面积之和。


5.百白破疫苗中黏附素的定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取百白破疫苗进行酶解前处理，得到酶解液，将酶解液定容得到待测液；
(2)将步骤(1)所得酶解液进行高效液相色谱串联质谱检测，根据黏附素特征肽段的色谱峰面积和标准工作曲线得到待测液中黏附素的含量，通过待测液体积与百白破疫苗体积的换算，得到百白破疫苗中黏附素的含量；
黏附素的特征肽段为：T...

【专利技术属性】
技术研发人员：龙珍，卫辰，李月琪，马霄，姚劲挺，冀峰，李长坤，骆鹏，王丽婵，黄涛宏，
申请(专利权)人：岛津企业管理中国有限公司，中国食品药品检定研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11