一种单细胞转录本异构体测序的分析方法和试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种单细胞转录本异构体测序的分析方法和试剂盒。本发明专利技术通过对单个mRNA的两个末端添加标签序列，捕获富集后进行全转录组测序，通过对不同转录异构体的首尾结构的准确判断来判断全长转录本，这一新的研究策略可解决现有的技术问题，具有以下有益效果：1、提高全长转录本检测的灵敏性：由于靶向转录本的首尾末端区域检测，信号多集中在转录本的末端边缘位置，因此对全长转录本的检测度更高。2、简单易行，成本低：方法简单易行，适用面广泛，成本低。3、提高对转录本检测的准确性：本发明专利技术结合末端序列的标签序列以及数据分析算法的优化，可达到更高的准确性。

An analysis method and kit for sequencing single cell transcripts isomers

【技术实现步骤摘要】
一种单细胞转录本异构体测序的分析方法和试剂盒
：本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种单细胞转录本异构体测序的分析方法和试剂盒。
技术介绍
：基因转录异构体的可变性导致基因功能的多样性，mRNA在转录起始位点、转录终止位点的不同选择可导致mRNA稳定性、定位以及翻译效率差异，甚至产生具有不同功能的截短型蛋白。研究证实，组成人体器官组织的单细胞之间存在功能和分子特征的显著异质性，现有的单细胞测序方法可区分不同细胞之间的基因表达差异，但这些方法大多基于mRNA的5’或者3’端的捕获测序，而不是检测全长转录本。目前报道的两种单细胞全长转录本测序方法存在灵敏度低、成本高等问题，比如smart2-seq，能够对单细胞转录组进行全长检测，但检测信号绝大部分分布在基因的中间部分，而在转录本的末端分布极少，导致其对全长转录本分析的灵敏性和准确性低。Pacbio长读长三代测序能对mRNA转录本进行全长测序，但存在成本高，错误率相对高等问题。
技术实现思路
：本专利技术的目的是提供一种灵敏度高、成本低廉、准确性好的单细胞转录本异构体测序的分析本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种单细胞转录本异构体测序的分析方法，其特征在于，包括以下步骤：/na、细胞裂解：分离单细胞，利用裂解液对单细胞进行裂解，得到裂解产物，裂解液中含有带有A标签序列的oligod T；/nb、利用逆转录酶对裂解产物进行逆转录，逆转录过程中，逆转录酶在逆转录形成的cDNA链3’末端添加上若干个C碱基，这些C碱基与带有B标签序列的、含有锁核酸的TSO引物匹配，达到模板转换，并通过TSO引物末端的标签序列以及干个C序列对转录cDNA的末端位置进行标注，带有标签序列的oligod T作为逆转录反应的引物，逆转录的同时给cDNA带上标签，由此得到逆转录生成cDNA第一条链；/nc、逆转录生成cDNA第...

【技术特征摘要】
1.一种单细胞转录本异构体测序的分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、细胞裂解：分离单细胞，利用裂解液对单细胞进行裂解，得到裂解产物，裂解液中含有带有A标签序列的oligodT；
b、利用逆转录酶对裂解产物进行逆转录，逆转录过程中，逆转录酶在逆转录形成的cDNA链3’末端添加上若干个C碱基，这些C碱基与带有B标签序列的、含有锁核酸的TSO引物匹配，达到模板转换，并通过TSO引物末端的标签序列以及干个C序列对转录cDNA的末端位置进行标注，带有标签序列的oligodT作为逆转录反应的引物，逆转录的同时给cDNA带上标签，由此得到逆转录生成cDNA第一条链；
c、逆转录生成cDNA第一条链之后，通过与cDNA两端引入的序列匹配的引物进行PCR扩增，即得到全长的转录组的cDNA；
d、全长扩增之后的cDNA，利用Tn5转座酶进行建库，cDNA片段化并加上测序通用接头构建文库，然后进行测序，根据在逆转录的时候添加进去的3’和5’的标签序列提取出其对应的序列，提取出来的序列比对基因组，提取出唯一比对序列，提取出来的数据，5’端的序列用CAGEr进行下游分析鉴定转录起始位点，3’端序列鉴定转录终止位点。


2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述的A标签序列和B标签序列相同或不同。


3.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述的步骤a中的裂解液中含有TritonX-100、RNA酶抑制剂、带有A标签序列的oligodT和dNTPs。


4.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡友金，钟嘉纬，丘远辉，饶品鸿，
申请(专利权)人：中山大学中山眼科中心，
类型：发明
国别省市：广东;44