一种单细胞转录本异构体测序的分析方法和试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种单细胞转录本异构体测序的分析方法和试剂盒。本发明专利技术通过对单个mRNA的两个末端添加标签序列，捕获富集后进行全转录组测序，通过对不同转录异构体的首尾结构的准确判断来判断全长转录本，这一新的研究策略可解决现有的技术问题，具有以下有益效果：1、提高全长转录本检测的灵敏性：由于靶向转录本的首尾末端区域检测，信号多集中在转录本的末端边缘位置，因此对全长转录本的检测度更高。2、简单易行，成本低：方法简单易行，适用面广泛，成本低。3、提高对转录本检测的准确性：本发明专利技术结合末端序列的标签序列以及数据分析算法的优化，可达到更高的准确性。

An analysis method and kit for sequencing single cell transcripts isomers

【技术实现步骤摘要】
一种单细胞转录本异构体测序的分析方法和试剂盒
：本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种单细胞转录本异构体测序的分析方法和试剂盒。
技术介绍
：基因转录异构体的可变性导致基因功能的多样性，mRNA在转录起始位点、转录终止位点的不同选择可导致mRNA稳定性、定位以及翻译效率差异，甚至产生具有不同功能的截短型蛋白。研究证实，组成人体器官组织的单细胞之间存在功能和分子特征的显著异质性，现有的单细胞测序方法可区分不同细胞之间的基因表达差异，但这些方法大多基于mRNA的5’或者3’端的捕获测序，而不是检测全长转录本。目前报道的两种单细胞全长转录本测序方法存在灵敏度低、成本高等问题，比如smart2-seq，能够对单细胞转录组进行全长检测，但检测信号绝大部分分布在基因的中间部分，而在转录本的末端分布极少，导致其对全长转录本分析的灵敏性和准确性低。Pacbio长读长三代测序能对mRNA转录本进行全长测序，但存在成本高，错误率相对高等问题。
技术实现思路
：本专利技术的目的是提供一种灵敏度高、成本低廉、准确性好的单细胞转录本异构体测序的分析方法和试剂盒。本专利技术的单细胞转录本异构体测序的分析方法，其包括以下步骤：a、细胞裂解：分离单细胞，利用裂解液对单细胞进行裂解，得到裂解产物，裂解液中含有带有A标签序列的oligodT；b、利用逆转录酶对裂解产物进行逆转录，逆转录过程中，逆转录酶在逆转录形成的cDNA链3’末端添加上若干个C碱基，这些C碱基与带有B标签序列的、含有锁核酸的TSO引物匹配，达到模板转换，并通过TSO引物末端的标签序列以及干个C序列对转录cDNA的末端位置进行标注，带有标签序列的oligodT作为逆转录反应的引物，逆转录的同时给cDNA带上标签，由此得到逆转录生成cDNA第一条链；c、逆转录生成cDNA第一条链之后，通过与cDNA两端引入的序列匹配的引物进行PCR扩增，即得到全长的转录组的cDNA；d、全长扩增之后的cDNA，利用Tn5转座酶进行建库，cDNA片段化并加上测序通用接头构建文库，然后进行测序，根据在逆转录的时候添加进去的3’和5’的标签序列提取出其对应的序列，提取出来的序列比对基因组，提取出唯一比对序列，提取出来的数据，5’端的序列用CAGEr进行下游分析鉴定转录起始位点，3’端序列鉴定转录终止位点。A标签序列和B标签序列可以相同，也可以不同。优选，所述的步骤a中的裂解液中含有TritonX-100、RNA酶抑制剂、带有A标签序列的oligodT和dNTPs。TritonX-100裂解细胞，RNA酶抑制剂可保证RNA的完整性；带有标签序列的oligodT作为逆转录反应的引物，逆转录的同时给cDNA带上标签；在这一步就加入dNTPs，可以达到提高RT-PCR的产量。优选，所述的步骤b中在逆转录反应体系中，添加了额外的镁离子和甜菜碱。有些RNA会形成二级结构(比如发卡或环状结构)，由于空间位阻可能会导致逆转录酶在RNA链上延伸的终止，甜菜碱及镁离子可以克服这种情况；另外有了甜菜碱热稳定性的保护能力，在42℃反应90min之后，可以升高温度至50℃保持2min这样有利于打开RNA的二级结构，然后再降低温度至42℃保持2min让逆转录反应继续，这样升温降温重复10个循环，最大限度地提高cDNA的产量。优选，所述的步骤c中的PCR扩增是有限循环，如18个循环足够。为简化步骤、提高检测灵敏性，防止cDNA的丢失，在合成第一条链后不经过纯化，直接用KAPAHiFiHotStartReadymix直接PCR扩增。所述的步骤d，其全长扩增之后的cDNA，利用illumina的Tn5转座酶进行建库，利用此方法，cDNA片段化及加上测序通用接头在同一个步骤中完成；片段化及加上测序接头引物的文库，利用带有与cDNA3’和5’引入的标签序列匹配的I5及I7index引物进行PCR，从而达到了对cDNA首尾两端的捕获富集，文库及建成，文库片段分布在200-400bp之间，用较少的测序数据量即可达到鉴定TSS及TES的需求。对测序数据进行分析、过滤、以及所检测TSS以及TES鉴定分析，具体是：测序得到的fastq文件，过滤掉低质量及测序接头序列，根据在逆转录的时候添加进去的3’和5’的标签序列提取出其对应的序列，提取出来的序列比对基因组，提取出唯一比对序列；提取出来的数据，5’端的序列用CAGEr进行下游分析鉴定转录起始位点；3’端序列鉴定转录终止位点。本专利技术的第二个目的是提供一种单细胞转录本异构体测序的试剂盒，其包括带有A标签序列的oligodT、带有B标签序列的、含有锁核酸的TSO引物和与cDNA第一链两端引入的序列匹配的引物。进一步优选，还含有裂解液、逆转录酶反应试剂、cDNAPCR反应试剂、Tn5转座酶和测序通用接头。所述的裂解液中含有TritonX-100、RNA酶抑制剂、带有A标签序列的oligodT和dNTPs。所述的cDNAPCR反应试剂是KAPAHiFiHotStartReadymix。本专利技术通过对单个mRNA的两个末端添加标签序列，捕获富集后进行全转录组测序，通过对不同转录异构体的首尾结构的准确判断来判断全长转录本，这一新的研究策略可解决现有的技术问题，具有以下有益效果：1、提高全长转录本检测的灵敏性：由于靶向转录本的首尾末端区域检测，信号多集中在转录本的末端边缘位置，因此对全长转录本的检测度更高。2、简单易行，成本低：方法简单易行，适用面广泛，成本低。另外，由于测序信号多集中在转录本的首尾，对于同样多的转录本的检测所需要的测序深度可降低，因此降低了测序成本。3、提高对转录本检测的准确性：本专利技术结合末端序列的标签序列以及数据分析算法的优化，可达到更高的准确性。附图说明：图1是本专利技术的分析方法的技术原理图；图2是本专利技术的分析方法与现有的单细胞测序方法效果比较图；图3是本专利技术的分析方法的准确性分析图；图4是本专利技术的分析方法鉴定出来的TSS及TES。具体实施方式：以下实施例是对本专利技术的进一步说明，而不是对本专利技术的限制。实施例1：本实施例的单细胞转录本异构体测序的分析方法的技术原理图如图1所示，所用到的引物序列如下(表1)：表1其中N为A、G、C或T、V为A、G或C。具体操作步骤如下：1、单细胞分离及裂解可以采用例如物理机械、化学、生物的方法，如微流控、流失细胞仪、口吸分离、梯度稀释等方法，分离得到包含完整转录组的单细胞。通过上述方法原代分离得到小鼠C57/B6品系的卵子细胞悬液，将细胞悬液加到培养皿上的PBS夜滴中，适度稀释，在显微镜下利用口吸管分离得到单细胞，所得单细胞放至含有4ul裂解液的PCR管中(控制分离的细胞在尽可能少的体积内)，每个细胞的裂解液具体配方如表2：表2成分(溶剂为水)体积<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种单细胞转录本异构体测序的分析方法，其特征在于，包括以下步骤：/na、细胞裂解：分离单细胞，利用裂解液对单细胞进行裂解，得到裂解产物，裂解液中含有带有A标签序列的oligod T；/nb、利用逆转录酶对裂解产物进行逆转录，逆转录过程中，逆转录酶在逆转录形成的cDNA链3’末端添加上若干个C碱基，这些C碱基与带有B标签序列的、含有锁核酸的TSO引物匹配，达到模板转换，并通过TSO引物末端的标签序列以及干个C序列对转录cDNA的末端位置进行标注，带有标签序列的oligod T作为逆转录反应的引物，逆转录的同时给cDNA带上标签，由此得到逆转录生成cDNA第一条链；/nc、逆转录生成cDNA第一条链之后，通过与cDNA两端引入的序列匹配的引物进行PCR扩增，即得到全长的转录组的cDNA；/nd、全长扩增之后的cDNA，利用Tn5转座酶进行建库，cDNA片段化并加上测序通用接头构建文库，然后进行测序，根据在逆转录的时候添加进去的3’和5’的标签序列提取出其对应的序列，提取出来的序列比对基因组，提取出唯一比对序列，提取出来的数据，5’端的序列用CAGEr进行下游分析鉴定转录起始位点，3’端序列鉴定转录终止位点。/n...

【技术特征摘要】
1.一种单细胞转录本异构体测序的分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、细胞裂解：分离单细胞，利用裂解液对单细胞进行裂解，得到裂解产物，裂解液中含有带有A标签序列的oligodT；
b、利用逆转录酶对裂解产物进行逆转录，逆转录过程中，逆转录酶在逆转录形成的cDNA链3’末端添加上若干个C碱基，这些C碱基与带有B标签序列的、含有锁核酸的TSO引物匹配，达到模板转换，并通过TSO引物末端的标签序列以及干个C序列对转录cDNA的末端位置进行标注，带有标签序列的oligodT作为逆转录反应的引物，逆转录的同时给cDNA带上标签，由此得到逆转录生成cDNA第一条链；
c、逆转录生成cDNA第一条链之后，通过与cDNA两端引入的序列匹配的引物进行PCR扩增，即得到全长的转录组的cDNA；
d、全长扩增之后的cDNA，利用Tn5转座酶进行建库，cDNA片段化并加上测序通用接头构建文库，然后进行测序，根据在逆转录的时候添加进去的3’和5’的标签序列提取出其对应的序列，提取出来的序列比对基因组，提取出唯一比对序列，提取出来的数据，5’端的序列用CAGEr进行下游分析鉴定转录起始位点，3’端序列鉴定转录终止位点。


2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述的A标签序列和B标签序列相同或不同。


3.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述的步骤a中的裂解液中含有TritonX-100、RNA酶抑制剂、带有A标签序列的oligodT和dNTPs。


4.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡友金，钟嘉纬，丘远辉，饶品鸿，
申请(专利权)人：中山大学中山眼科中心，
类型：发明
国别省市：广东;44