一种通用的食用菌发酵物料中重要微生物的鉴定方法技术

本发明专利技术提供了一种通用的食用菌发酵物料中重要微生物的鉴定方法，包括以下步骤：S1、采样培养：从食用菌二次发酵料中采集出仓二次料后，进行活化；S2、筛选与纯化：将活化后的出仓二次料采用不同培养基进行培养，待菌落半径扩大至1厘米后，再接种进行纯化培养；S3、鉴定：将纯化培养后的菌落进行基因组DNA提取，然后进行PCR扩增，所得产物回收后进行DNA测序，并通过比对即得到各菌落的鉴定结果。本发明专利技术的方法可同时得到多种不同类型的微生物，鉴定结果准确、可靠，为食用菌发酵物料中的重要微生物的作用研究奠定了基础。

A general identification method of important microorganisms in fermentation materials of edible fungi

The invention provides a general identification method of important microorganisms in the fermentation materials of edible fungi, which includes the following steps: S1. Sampling and culture: after collecting the secondary materials from the secondary fermentation materials of edible fungi, activation is carried out; S2. Screening and purification: the secondary materials after activation are cultured in different media, and after the colony radius is expanded to 1cm, pure inoculation is carried out Chemical culture; S3. Identification: extract genomic DNA from the purified culture colonies, then PCR amplification, and then DNA sequencing after the products are recovered, and the identification results of each colony can be obtained by comparison. The method of the invention can obtain a variety of different types of microorganisms at the same time, and the identification result is accurate and reliable, which lays a foundation for the study of the role of important microorganisms in the fermentation materials of edible fungi.

【技术实现步骤摘要】
一种通用的食用菌发酵物料中重要微生物的鉴定方法
本专利技术涉及食用菌培养料中的微生物分离纯化鉴定
，具体地说，涉及一种通用的食用菌发酵物料中重要微生物的鉴定方法。
技术介绍
随着人们生活水平的提高，市场对于食用菌的需求越来越大，生产食用菌需要制备大量培养料，制备良好的培养料中含有大量的有益微生物，其中，有些重要微生物必须在培养料的发酵过程中才能正常生长，有些重要微生物可以在分离纯化后人工培养，本专利技术适用于可以人工培养的微生物。某种微生物分离纯化成功后，再通过NCBI物种相似度比对进行鉴定，鉴定完成后即可研究此种微生物在食用菌培养料发酵过程中的作用。
技术实现思路
针对现有技术的缺陷，本专利技术的目的是提供一种通用的食用菌发酵物料中重要微生物的鉴定方法。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：本专利技术提供了一种通用的食用菌发酵物料中重要微生物的鉴定方法，包括以下步骤：S1、采样培养：从食用菌二次发酵料中采集出仓二次料后，进行活化；S2、筛选与纯化：将活化后的出仓二次料采用不同培养基进行培养，待菌落半径扩大至1厘米后，再接种进行纯化培养；S3、鉴定：将纯化培养后的菌落进行基因组DNA提取，然后进行PCR扩增，所得产物回收后进行DNA测序，并通过比对即得到各菌落的鉴定结果。优选地，所述食用菌为双孢蘑菇。优选地，步骤S1中，所述活化的条件为：将出仓二次料封装后置于55℃、湿度约为60％的培养箱中活化12小时。优选地，步骤S2中，所述培养基包括PGA培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、孟加拉红培养基、改良高氏1号培养基。优选地，所述PGA培养基的制备为：以1L水的量计，将蛋白胨5.0g，葡萄糖10.0g，酵母粉1.0g，碳酸钙3g，氯化钠5g，琼脂15g溶解在水中，在121℃灭菌20min；所述牛肉膏蛋白胨培养基的制备为：以1L水的量计，将牛肉膏5g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，琼脂18.0g溶解在蒸馏水中，调节pH7.0～7.2；121℃灭菌20min；所述孟加拉红培养基的制备为：以1L水的量计，将蛋白胨5.0g，葡萄糖10.0g，磷酸二氢钾1.0g，硫酸镁0.5g，琼脂20.0g，孟加拉红0.033g，氯霉素0.1g溶解在蒸馏水中，121℃灭菌30min；所述改良高氏1号培养基的制备为：以1L水的量计，将可溶性淀粉20.0g，硝酸钾1.0g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.5g，硫酸亚铁0.01g，氯化钠0.5g，琼脂18.0g溶解在蒸馏水中，调节pH7.2-7.4；配制时将可溶性淀粉先加少量冷蒸馏水调成糊状后，再加入沸蒸馏水中；121C，20min灭菌；临用时在每300mL培养基中加3％重铬酸钾1mL。优选地，步骤S2中，所述培养基为PGA培养基、牛肉膏蛋白胨培养基时，培养方法如下：取5至10克出仓二次料浸没于无菌水中，振荡后，吸取一定量的出仓二次料浸出液，将浸出液稀释出10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6六个浓度梯度，将6个浓度的菌液分别涂布于PGA培养基、牛肉膏蛋白胨培养基上；将已涂布有菌液的培养基倒置于55℃、湿度为60％～80％的培养箱中，恒温培养。优选地，步骤S2中，所述培养基为孟加拉红培养基、改良高氏1号培养基时，培养方法如下：取1.5-2.5厘米的出仓二次料接种在培养基上，倒置于55℃、湿度为70％的培养箱中，恒温培养。优选地，步骤S3中，所述基因组DNA提取的方法如下：A、将纯化后的菌体加入缓冲液GA中振荡，得悬浮液；B、在悬浮液中加入ProteinaseK溶液，混匀；C、向步骤B所得溶液中加入缓冲液GB，振荡后，放置一段时间，然后离心去除水珠；D、向步骤C所得溶液中加入无水乙醇，振荡摇匀；E、将步骤D所得混合物加入吸附柱中，离心去除废液；F、然后加入缓冲液GD，再离心去除废液；G、再加入漂洗液，离心去除废液；H、重复步骤E-G，所得离心液再次离心去除废液后，室温放置；I、向步骤H处理后的吸附柱滴加洗脱缓冲液TE，室温放置后离心，收集溶液。优选地，步骤S3中，所述PCR扩增采用的引物对序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。与现有技术相比，本专利技术具有如下的有益效果：本专利技术通过配制能够筛选出细菌、真菌、放线菌的不同培养基，将培养料浸出液涂布在培养基上，在特定环境(根据重要微生物的生长习性而定)中进行培养以筛选获得单菌落，再将单菌落进行纯化，从已经纯化的菌种中提取基因组DNA，然后基因组PCR扩增，PCR产物用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒回收，取各个菌种纯化后的PCR产物，使用测序仪ABI3730-XL进行DNA测序，最后用NCBIBlast程序将拼接后的序列文件与NCBI核酸数据库中的数据进行比对，得到与待测物种序列相似性最大的物种信息，即为鉴定结果。本专利技术的方法可同时得到多种不同类型的微生物，鉴定结果准确、可靠，为食用菌发酵物料中的重要微生物的作用研究奠定了基础。附图说明通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本专利技术的其它特征、目的和优点将会变得更明显：图1为本专利技术实施例1采用牛肉膏蛋白胨培养基进行培养的结果；图2为本专利技术实施例1采用改良高氏1号培养基进行培养的结果；图3为本专利技术实施例1采用PGA培养基进行培养的结果；图4为本专利技术实施例1采用孟加拉红培养基进行培养的结果。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本专利技术，但不以任何形式限制本专利技术。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本专利技术的保护范围。实施例1本实施例提供了一种分离纯化鉴定双孢蘑菇二次发酵料中的高温菌的方法，不可以下步骤：1、培养基的制备：1.1PGA培养基：蛋白胨5.0g，葡萄糖10.0g，酵母粉1.0g，碳酸钙3g，氯化钠5g，琼脂15g溶解在1L水中，在121℃灭菌20min。1.2牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，琼脂18.0g，蒸馏水1000mL，pH7.0～7.2；121℃灭菌20min；用于分离培养好氧细菌。1.3孟加拉红培养基：蛋白胨5.0g，葡萄糖10.0g，磷酸二氢钾1.0g，硫酸镁0.5g，琼脂20.0g，孟加拉红0.033g，氯霉素0.1g，蒸馏水1000mL；121℃灭菌30min；用于分离培养丝状真菌。1.4改良高氏1号培养基：可溶性淀粉20.0g，硝酸钾1.0g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.5g，硫酸亚铁0.01g，氯化钠0.5g，琼脂18.0g，蒸馏水1000mL，pH7.2-7.4；配制时将淀粉先加少量冷水调成糊状后，再加入沸水中；121C灭菌20m本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种通用的食用菌发酵物料中重要微生物的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1、采样培养：从食用菌二次发酵料中采集出仓二次料后，进行活化；/nS2、筛选与纯化：将活化后的出仓二次料采用不同培养基进行培养，待菌落半径扩大至1厘米后，再接种进行纯化培养；/nS3、鉴定：将纯化培养后的菌落进行基因组DNA提取，然后进行PCR扩增，所得产物回收后进行DNA测序，并通过比对即得到各菌落的鉴定结果。/n

【技术特征摘要】
1.一种通用的食用菌发酵物料中重要微生物的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、采样培养：从食用菌二次发酵料中采集出仓二次料后，进行活化；
S2、筛选与纯化：将活化后的出仓二次料采用不同培养基进行培养，待菌落半径扩大至1厘米后，再接种进行纯化培养；
S3、鉴定：将纯化培养后的菌落进行基因组DNA提取，然后进行PCR扩增，所得产物回收后进行DNA测序，并通过比对即得到各菌落的鉴定结果。


2.根据权利要求1所述的通用的食用菌发酵物料中重要微生物的鉴定方法，其特征在于，步骤S1中，所述活化的条件为：将出仓二次料封装后置于55℃、湿度约为60％的培养箱中活化12小时。


3.根据权利要求1所述的通用的食用菌发酵物料中重要微生物的鉴定方法，其特征在于，步骤S2中，所述培养基包括PGA培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、孟加拉红培养基、改良高氏1号培养基。


4.根据权利要求3所述的通用的食用菌发酵物料中重要微生物的鉴定方法，其特征在于，所述PGA培养基的制备为：以1L水的量计，将蛋白胨5.0g，葡萄糖10.0g，酵母粉1.0g，碳酸钙3g，氯化钠5g，琼脂15g溶解在水中，在121℃灭菌20min；
所述牛肉膏蛋白胨培养基的制备为：以1L水的量计，将牛肉膏5g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，琼脂18.0g溶解在蒸馏水中，调节pH7.0～7.2；121℃灭菌20min；
所述孟加拉红培养基的制备为：以1L水的量计，将蛋白胨5.0g，葡萄糖10.0g，磷酸二氢钾1.0g，硫酸镁0.5g，琼脂20.0g，孟加拉红0.033g，氯霉素0.1g溶解在蒸馏水中，121℃灭菌30min；
所述改良高氏1号培养基的制备为：以1L水的量计，将可溶性淀粉20.0g，硝酸钾1.0g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.5g，硫酸亚铁0.01g，氯化钠0.5g，琼脂18.0g溶解在蒸馏水中，调节pH7.2-7.4；配制时将可溶性淀粉先加少量冷蒸馏水调成糊状后，再加入沸...

【专利技术属性】
技术研发人员：隽加香，高照亮，黄建春，陈明杰，王倩，肖婷婷，陈辉，宋晓霞，张津京，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：上海;31