一种基于计算机模拟获取可调控的TRPV5变异体的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于计算机模拟获取可调控的TRPV5变异体的方法。所述方法首先采用CHARMM‑GUI对通道蛋白质进行变异处理，随后使用Amber16中的分子动力学模拟模块pmemd.cuda对不同状态下的TRPV5通道蛋白变异体阳离子进行模拟，最后结合使用VMD和Amber16中的cpptraj模块分析阳离子的运动路径，来验证该TRPV5通道蛋白变异体的通道性能。本发明专利技术可对整个模拟体系的运动轨迹进行研究解析，克服了中间状态难以连续观测的难题，并且能够直观地观测到阳离子在极短的时间尺度内的运动变化。整个计算过程效率高，耗时短，操作简单，有助于在生物化学、蛋白质工程学等领域的广泛应用。

A method of obtaining controllable TRPV5 variants based on computer simulation

【技术实现步骤摘要】
一种基于计算机模拟获取可调控的TRPV5变异体的方法
本专利技术属于分子动力学计算机模拟
更具体地，涉及一种基于计算机模拟获取可调控的TRPV5变异体的方法。
技术介绍
瞬态感受器电位阳离子通道蛋白(TransientReceptorPotentialcationchannels,TRPchannels)是一类广泛存在于生物体的阳离子通道蛋白，其中TRPV5是瞬时性受体电位(TRP)通道超家族成员中TRPV亚家族通道中一员，是该家族蛋白中子类为V，成员5的阳离子通道蛋白。该通道蛋白由729个氨基酸构成，分子量约为83kDa。相应的基因由在7q34染色体排列的15个外显子组成，主要分布于肾脏、破骨细胞、胎盘等。其中，肾小管中分布较高，主要表达于远曲小管和收集小管中的肾上皮细胞的顶端细胞膜中，另在破骨细胞中也有表达，其表达量虽不如在肾脏的高表达，但也提示TRPV5是介导破骨细胞骨吸收的重要通道蛋白。研究证实其与肾脏中Ca2+主动重吸收相关，TRPV5是TRP家族中一个独特的钙选择性离子通道。首先，当该通道打开时，TRPV5允许尿液中的钙离子沿浓度梯度进入细胞中，钙离子通过TRPV5进入细胞后，结合到钙结合蛋白D28K上弥散到基底外侧膜。对小鼠的研究中敲除相关TRPV5基因的小鼠都出现了不同程度的体内离子浓度失调和尿液含钙过高的情况。而对不同的人群的研究也表明，非裔美国人的低肾结石风险也与TRPV5的表达紧密相关。因此肾脏表皮细胞中的TRPV5钙离子主动再吸收过程对人体起重要作用。对TRPV5的机理探讨、结构修饰与调控等研究将有利于促进现代医学对肾脏疾病的认知，为治愈钙离子失衡所导致的疾病提供新的研究角度。目前，多使用益康唑(Econazol)、携钙素(Calmodulin，CaM)与TRPV5出口处残基结合，通过溶胶电泳等实验手段对TRPV5的钙离子传导进行调节，研究TRPV5的结构、电生理特性及调控因素。但是实验研究具有一定的局限性，影响导向较为单一，且逆反应可操作性较差，益康唑、携钙素等物质一旦与TRPV5出口结合就不容易脱离，且往往需要多个化合物与残基进行结合才可达到理想的调控效果，成本较高。对TRPV5通道蛋白的变异体研究由于实验繁杂，培养时间长，不易于操作，成为了TRPV5的研究瓶颈。此外，由于TRPV5传导钙离子的过程非常短暂，实验上难以捕捉离子传导过程，无法连续性观测TRPV5的动态调控过程，使得对TRPV5的传导性能和蛋白质结构设计研究受限。利用计算机模拟构建蛋白质结构模型的方法可以节省实验成本，效率高。但通过计算机模拟蛋白质工程和酶催化残基磷酸化修饰技术来构建TRPV5通道蛋白变异体结构的研究未见报道。理论上，可以基于反应分子动力学方法通过计算机模拟蛋白质与离子反应过程从而构建离子摄入过程的复杂蛋白变异体最终结构，但由于变异体数量较多，仅使用变异体的最终结构进行比较，难以全面评估不同变异体的性能，同时存在离子传导连续状态难以观测、反应亲和力不可控、模拟时间长、计算量大、速度慢等技术难题，不利于TRPV5在生物化学、蛋白质工程学等学科进一步研究。
技术实现思路
本专利技术的首要目的是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供一种基于计算机模拟获取可人工调控的TRPV5通道蛋白变异体的方法，通过分步模拟以及借助VMD、cpptraj模块等多种可视化工具对模拟体系进行连续性观测，从而可以更直观地观测到TRPV5通道蛋白的离子摄入过程。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：一种基于计算机模拟获取可人工调控的TRPV5通道蛋白变异体的方法，包括以下步骤：S1.分析TRPV5蛋白结构关键位点，对关键位点进行突变修饰，获得失去摄取钙离子能力的TRPV5通道蛋白突变体A1，使通道关闭；S2.对S1所述突变体A1的已突变位点进行磷酸化修饰，获得若干可摄入钙离子的TRPV5通道蛋白突变体A2，使通道打开；S3.将待摄入的钙离子分别置于S1所述突变体A1、S2所述突变体A2的通道入口附近，并使用CHARMM-GUI软件将S1所述突变体A1、S2所述突变体A2分别构建成细胞膜结构模型；所述细胞膜结构模型包括变异体A1或变异体A2、以及待摄入钙离子、溶质离子、磷脂双分子层和溶剂；S4.使用分子动力学模拟软件中的动力学模拟模块，结合最陡下降法和共轭梯度法对S3所述细胞膜结构模型分别进行能量最小化优化，获得能量优化后体系；S5.对S4所述能量优化后体系中的蛋白质重原子和钙离子进行位置限制，随后使用分子动力学模拟软件中的动力学模拟模块对体系进行预平衡模拟，获得预平衡体系；S6.在分子动力学模拟软件中的动力学模拟模块，对S5所得预平衡体系进行分子动力学模拟，获得钙离子运动轨迹；S7.结合VMD程序和软件测距工具，对不同变异体的通道入口处进行观察钙离子是否进入其离子通道，并根据S6所得的钙离子运动轨迹分析其钙离子运动情况，获得不同变异路线中的初始最优变异体；S8.得到初始最优变异体后，重新进行动力学模拟(包括能量最小化优化、预平衡模拟和分子动力学模拟，并且各参数与之前的模拟一致)从而进一步测试钙离子摄入能力，动力学模拟结束后获得含有若干晶体结构输出文件和体系各原子的运动轨迹文件，待进一步验证钙离子在更远的距离能否被通道蛋白突变体摄入；S9.先使用ambpdb模块将S8所述若干晶体结构输出文件转化成适用于观察的PDB文件，再使用VMD可视化软件观测晶体结构输出文件中钙离子的最终位置，并使用分子动力学模拟软件中的分析模块对S8所述运动轨迹文件进行分析，根据分析结果选择确定最终最优的TRPV5通道蛋白变异体。目前实验研究均集中于TRPV5离子通道出口处残基，由于变异体研究步骤繁多且耗时长，少有对TRPV5通道蛋白入口处进行残疾修饰的研究；另外，现有的实验观测和计算机模拟都着眼于捕捉体系的中间态结构，而蛋白质通道内离子摄入是一个连续性过程，存在离子传导连续状态难以观测的不足。本专利技术方法首先采用CHARMM-GUI对通道蛋白质进行变异处理，随后使用Amber16中的分子动力学模拟模块pmemd.cuda对不同状态下的TRPV5通道蛋白变异体阳离子进行模拟，反应度可控；最后结合VMD分子可视化软件和Amber16中的Cpptraj数据提取模块，分析阳离子的运动路径，通过在原子水平上对整个模拟体系的运动轨迹进行解析，克服了中间状态难以连续观测的难题，本专利技术能够更加直观地观测到阳离子在极短的时间尺度内的运动变化。整个模拟过程时间短、计算过程效率高，耗时短、效率高，操作简单，可以弥补实验研究的不足。在本专利技术较佳的实施例中，S1所述关键位点为542号天冬氨酸(Asp542)。更进一步地，在本专利技术较佳的实施例中，所述对关键位点进行突变修饰为：将TRPV5通道蛋白的542号天冬氨酸分别变异为丝氨酸突变体(D542S)、苏氨酸突变体(D542T)和酪氨酸突变体(D542Y)。在本专利技术较佳的实施例中，S2所述磷酸化修饰为：通过CHARMM-GUI软件对所本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于计算机模拟获取可调控的TRPV5变异体的方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1.分析TRPV5蛋白结构关键位点，对关键位点进行突变修饰，获得失去摄取钙离子能力的TRPV5通道蛋白突变体A1，使通道关闭；/nS2.对S1所述突变体A1的已突变位点进行磷酸化修饰，获得若干可摄入钙离子的TRPV5通道蛋白突变体A2，使通道打开；/nS3.将待摄入的钙离子分别置于S1所述突变体A1、S2所述突变体A2的通道入口附近，并使用CHARMM-GUI软件将S1所述突变体A1、S2所述突变体A2分别构建成细胞膜结构模型；所述细胞膜结构模型包括变异体A1或变异体A2、以及待摄入钙离子、溶质离子、磷脂双分子层和溶剂；/nS4.使用分子动力学模拟软件中的动力学模拟模块，结合最陡下降法和共轭梯度法对S3所述细胞膜结构模型分别进行能量最小化优化，获得能量优化后体系；/nS5.对S4所述能量优化后体系中的蛋白质重原子和钙离子进行位置限制，随后使用分子动力学模拟软件中的动力学模拟模块对体系进行预平衡模拟，获得预平衡体系；/nS6.在分子动力学模拟软件中的动力学模拟模块，对S5所得预平衡体系进行分子动力学模拟，获得钙离子运动轨迹；/nS7.结合VMD程序和软件测距工具，对不同变异体的通道入口处进行观察钙离子是否进入其离子通道，并根据S6所得的钙离子运动轨迹分析其钙离子运动情况，获得不同变异路线中的初始最优变异体；/nS8.得到初始最优变异体后，重新进行动力学模拟从而进一步测试钙离子摄入能力，动力学模拟结束后获得含有若干晶体结构输出文件和体系各原子的运动轨迹文件，待进一步验证钙离子在更远的距离能否被通道蛋白突变体摄入；/nS9.先使用ambpdb模块将S8所述若干晶体结构输出文件转化成适用于观察的PDB文件，再使用VMD可视化软件观测晶体结构输出文件中钙离子的最终位置，并使用分子动力学模拟软件中的分析模块对S8所述运动轨迹文件进行分析，根据分析结果选择确定最终最优的TRPV5通道蛋白变异体。/n...

【技术特征摘要】
1.一种基于计算机模拟获取可调控的TRPV5变异体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.分析TRPV5蛋白结构关键位点，对关键位点进行突变修饰，获得失去摄取钙离子能力的TRPV5通道蛋白突变体A1，使通道关闭；
S2.对S1所述突变体A1的已突变位点进行磷酸化修饰，获得若干可摄入钙离子的TRPV5通道蛋白突变体A2，使通道打开；
S3.将待摄入的钙离子分别置于S1所述突变体A1、S2所述突变体A2的通道入口附近，并使用CHARMM-GUI软件将S1所述突变体A1、S2所述突变体A2分别构建成细胞膜结构模型；所述细胞膜结构模型包括变异体A1或变异体A2、以及待摄入钙离子、溶质离子、磷脂双分子层和溶剂；
S4.使用分子动力学模拟软件中的动力学模拟模块，结合最陡下降法和共轭梯度法对S3所述细胞膜结构模型分别进行能量最小化优化，获得能量优化后体系；
S5.对S4所述能量优化后体系中的蛋白质重原子和钙离子进行位置限制，随后使用分子动力学模拟软件中的动力学模拟模块对体系进行预平衡模拟，获得预平衡体系；
S6.在分子动力学模拟软件中的动力学模拟模块，对S5所得预平衡体系进行分子动力学模拟，获得钙离子运动轨迹；
S7.结合VMD程序和软件测距工具，对不同变异体的通道入口处进行观察钙离子是否进入其离子通道，并根据S6所得的钙离子运动轨迹分析其钙离子运动情况，获得不同变异路线中的初始最优变异体；
S8.得到初始最优变异体后，重新进行动力学模拟从而进一步测试钙离子摄入能力，动力学模拟结束后获得含有若干晶体结构输出文件和体系各原子的运动轨迹文件，待进一步验证钙离子在更远的距离能否被通道蛋白突变体摄入；
S9.先使用ambpdb模块将S8所述若干晶体结构输出文件转化成适用于观察的PDB文件，再使用VMD可视化软件观测晶体结构输出文件中钙离子的最终位置，并使用分子动力学模拟软件中的分析模块对S8所述运动轨迹文件进行分析，根据分析结果选择确定最终最优的TRPV5通道蛋白变异体。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S1所述关键位点为542号天冬氨酸(Asp542)。
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【专利技术属性】
技术研发人员：沈勇，谭俊杰，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东;44