一种共固定化酶及其制备方法和用途技术

本发明专利技术涉及一种共固定化酶及其制备方法和用途，所述共固定化酶是以海藻酸钠‑CaCl

A co immobilized enzyme and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种共固定化酶及其制备方法和用途
本专利技术涉及酶固定技术，尤其是一种共固定化酶及其制备方法和用途。
技术介绍
共固定化酶指通过把两种及以上的酶同时在同一个载体内进行固定化而产生共固定化体系的一种固定化技术。共固定化酶可以充分发挥不同种酶的各自催化特点，结合各自的酶催化特性，将两者协同起来充分利用，增加其对于复杂底物的催化反应效率。同时可减少其反应的步骤和时间，能更好地提升产品的效能。现有技术中有学者将纤维素酶和溶菌酶共固定化于氨基功能化磁性纳米颗粒表面，用于细胞壁降解反应。固定化过程中纤维素酶与溶菌酶的竞争是由于MNPs活性位点有限所致。最大限度活性位点中78.9％纤维素酶和69.6％溶菌酶是双酶共固定化的协同效应。共固定化酶半衰期的热稳定性为3h，对细胞壁水解具有较高的催化效率。此外，与游离酶相比，共固定化酶具有更高的热稳定性和较宽的pH耐受性。经过再循环6次使用后，共固定化酶保留了60％的残余活性。专利申请CN107012138A公开了一种硅/碳基复合固定化酶环保材料及其制备方法。该环保材料是将复合生物酶固定化于改性处理后的硅-碳基载体上，这些载体含有纳米尺度微晶结构共聚体，形成改性硅-碳基固定化酶生物材料。这种材料必须先经过改性，操作复杂。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有的酶固定技术不足，材料的稳定性不佳的问题，提供一种共固定化酶及其制备方法和用途。本专利技术的关键之一在于制备出酶与载体结合效果好的共固定化酶，专利技术人发现，其影响因素从主到次的排列为：活性炭投加量>海藻酸钠浓度>CaCl2浓度。由于活性炭的影响最大，则其投加量越多吸附越好，而对于海藻酸钠溶液和CaCl2溶液，两者浓度越高胶球内部各组分就越紧密而不利于底物的传质，产生位阻效应。故最优方案为：复合酶溶液200mL，活性炭投加量为0.15g，海藻酸钠浓度为2％，CaCl2浓度为2％。在该条件下，该空碳胶球的吸附性能和传质效果最佳，若将游离酶附着在胶球内制备出固定化酶，底物在胶球中进出也更容易，即传质效果更好，且内部酶与其底物会得到更好的接触效果，从而催化反应速率更高，可表现出更好的酶活性，因此在本研究中采用该条件来制备固定化酶。本专利技术所使用的固定化载体是海藻酸钠-活性炭复合载体，采用吸附和包埋的方法对漆酶和过氧化氢酶进行共固定，与常规固定化载体和固定化方法具有明显的不同之处。因此，本专利技术的固定化方法操作性更加简单，固定材料也较简易；且本专利技术的复合载体无需改性。具体方案如下：一种共固定化酶，所述共固定化酶是以海藻酸钠-CaCl2凝胶和活性炭为载体，将过氧化氢酶和漆酶进行固定。进一步的，所述共固定化酶的最适温度为45℃；任选的，所述共固定化酶的操作稳定性高，在25℃下经过5次的循环使用后，过氧化氢酶和漆酶仍然保留超过61％和超过74％的活性。进一步的，所述共固定化酶的贮存稳定性好，在4℃下贮存30日后，固定化过氧化氢酶和漆酶仍然保留超过65％和超过61％的活性。一种所述的共固定化酶的制备方法，包括以下步骤：步骤1：配置过氧化氢酶和漆酶的混合缓冲溶液；步骤2：将复合酶溶液与活性炭混合均匀，待吸附完全后，加入海藻酸钠，继续搅拌均匀并降温，采用注射器来制粒，将混合液滴加进CaCl2的水溶液中，生成光滑小球，固定化胶球在CaCl2的水溶液中被硬化，之后用水洗涤，干燥，得到共固定化酶。进一步的，所述步骤1包括1a将过氧化氢酶冻干粉用磷酸盐缓冲液溶解，得到过氧化氢酶溶液，1b将漆酶冻干粉用醋酸-醋酸钠缓冲液溶解，得到漆酶溶液，1c将过氧化氢酶溶液和漆酶溶液混合。进一步的，所述磷酸盐缓冲液的pH＝6-7，浓度为0.05-0.1M；任选的，所述过氧化氢酶溶液中过氧化氢酶的浓度为0.5-1.25mg/mL；任选的，所述醋酸-醋酸钠缓冲液的pH＝4-5，浓度为0.2-0.3M；任选的，所述漆酶溶液中漆酶的浓度为0.5-1.25mg/mL；任选的，所述过氧化氢酶溶液和漆酶溶液混合时，过氧化氢酶和漆酶的质量比为1:2-2:1。进一步的，所述步骤2中，活性炭的加量与复合酶溶液w:v的比例为1:100，海藻酸钠溶液的加量与复合酶溶液的体积比例为1:5；任选的，海藻酸钠为质量浓度1-3％的水溶液。进一步的，所述步骤2中，CaCl2的水溶液质量浓度为1-3％。进一步的，所述步骤2中，冰水浴降温至0-4℃，固定化时间为30-60min。本专利技术还保护所述的共固定化酶的用途，用于苯胺废水处理。有益效果：本专利技术采用包埋法和物理吸附法两种方法相结合进行酶固定化，所得到的共固定化酶的耐热性、耐酸碱性、贮存稳定性和操作稳定性均得到明显提升，对苯胺废水具有优异处理效果，对苯胺废水的操作稳定性较好，可以极大地降低实际应用于废水处理的成本。附图说明为了更清楚地说明本专利技术的技术方案，下面将对附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅涉及本专利技术的一些实施例，而非对本专利技术的限制。图1是本专利技术一个实施例2提供的游离酶浓度对固定化酶活的影响图；图2是本专利技术一个实施例3提供的固定化时间对固定化酶活的影响图；图3是本专利技术一个实施例4提供的过氧化氢酶和漆酶的比例对共固定化酶活的影响图；图4是本专利技术一个实施例5提供的反应温度对共固定化酶活的影响图；图5是本专利技术一个实施例6提供的反应pH对共固定化酶活的影响图；图6是本专利技术一个实施例7提供的贮存时间对共固定化酶活的影响图；图7是本专利技术一个实施例8提供的重复使用次数对共固定化酶活的影响图；图8是本专利技术一个实施例9提供的游离过氧化氢酶与固定化后过氧化氢酶的双倒数图；图9是本专利技术一个实施例9提供的游离漆酶与固定化后漆酶的双倒数图。具体实施方式下面将更详细地描述本专利技术的优选实施方式。虽然以下描述了本专利技术的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本专利技术而不应被这里阐述的实施方式所限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。在下面的实施例中，如未明确说明，“％”均指重量百分比。以下使用的测试方法包括：一、酶活的测定：由于本专利技术实施例所使用的酶均为市售工业制品，其纯品难以生产，酶冻干粉里或多或少会存在有一定杂质，故所配制的酶溶液中酶的含量可以用其催化反应的能力来表示，即酶活力。酶活力也是催化反应的速度。酶催化反应速度是指单位时间内产物生成的量或底物减少的量。酶活力并不等于酶的绝对含量，它只是一种相对含量的表示方式。先绘制标准曲线，如下：(1)过氧化氢标准曲线的绘制：准确配制出不同浓度的H2O2溶液，在H2O2的特征波长240nm下测定其吸光度值A，其溶液浓度(mmol/L)作为横坐标，所对应的吸光本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种共固定化酶，其特征在于：所述共固定化酶是以海藻酸钠-CaCl

【技术特征摘要】
1.一种共固定化酶，其特征在于：所述共固定化酶是以海藻酸钠-CaCl2凝胶和活性炭为载体，将过氧化氢酶和漆酶进行固定。


2.根据权利要求1所述的共固定化酶，其特征在于：所述共固定化酶的最适温度为45℃；
任选的，所述共固定化酶的操作稳定性高，在25℃下经过5次的循环使用后，过氧化氢酶和漆酶仍然保留超过61％和超过74％的活性。


3.根据权利要求1或2所述的共固定化酶，其特征在于：所述共固定化酶的贮存稳定性好，在4℃下贮存30日后，固定化过氧化氢酶和漆酶仍然保留超过65％和超过61％的活性。


4.一种权利要求1-3中任一项所述的共固定化酶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1：配置过氧化氢酶和漆酶的混合缓冲溶液；
步骤2：将复合酶溶液与活性炭混合均匀，待吸附完全后，加入海藻酸钠，继续搅拌均匀并降温，采用注射器来制粒，将混合液滴加进CaCl2的水溶液中，生成光滑小球，固定化胶球在CaCl2的水溶液中被硬化，之后用水洗涤，干燥，得到共固定化酶。


5.根据权利要求4所述的共固定化酶的制备方法，其特征在于：所述步骤1包括1a将过氧化氢酶冻干粉用磷酸盐缓冲液溶解，得到过氧化氢酶溶液，1b将漆酶冻干粉用醋酸-醋酸钠缓冲液溶解...

【专利技术属性】
技术研发人员：傅海燕，金月正，吴义诚，朱宏达，刘征，梁健臻，吴冬阳，
申请(专利权)人：厦门理工学院，
类型：发明
国别省市：福建;35