一种恶性神经鞘瘤异种移植小鼠模型的构建方法技术

本发明专利技术提供一种恶性神经鞘瘤异种移植小鼠模型的构建方法，所述方法包括先复苏保存在液氮环境中的恶性神经鞘瘤患者肿瘤组织块，再在无菌条件下将复苏的患者肿瘤组织块异种皮下移植进免疫缺陷小鼠体内，所述异种皮下移植包括选用年龄在2～6周的免疫缺陷小鼠，小鼠性别与患者性别保持一致，将复苏的患者肿瘤组织块浸泡在含胎牛血清的无菌孵育液中，小鼠麻醉后固定，将患者肿瘤组织块植入小鼠的皮下，缝合切口，饲养小鼠使得其体内肿瘤生长。本发明专利技术还包括将冻存复苏的患者肿瘤组织块异种原位移植进免疫缺陷小鼠体内。本发明专利技术使用异种移植小鼠代替临床患者进行不同组合药物筛选，从而选择最合适的药物，大大提高有效性并降低药物副作用。

Construction of xenotransplantation mouse model of malignant schwannoma

【技术实现步骤摘要】
一种恶性神经鞘瘤异种移植小鼠模型的构建方法
本专利技术涉及肿瘤移植小鼠模型的建立领域，具体涉及一种恶性神经鞘瘤异种移植小鼠模型的构建方法。
技术介绍
恶性神经鞘瘤亦称为神经肉瘤，来源于周围神经鞘，由恶性神经母细胞组成，多由神经纤维瘤或神经鞘瘤恶变而来。其恶性程度高，易发生肺转移，致残率与死亡率极高，预后差。恶性神经鞘瘤为社会乃至国家带来了沉重的经济负担，带来了更大的社会问题。因为恶性神经鞘瘤异质性的存在，既往基于恶性神经鞘瘤细胞系的基础研究结果很少可以在临床恶性神经鞘瘤患者体内得到重现，加上疾病发病率低，就导致了临床恶性神经鞘瘤诊治水平的滞后。专利技术专利申请CN201710822683.2公开了人NF2-/-前庭神经鞘瘤施旺细胞系的建立方法及其细胞系。该建立方法包括：A、对肿瘤中的施万细胞进行分离，获得人NF2-/-的原代施万细胞进行原代培养；B、建立免疫缺陷小鼠坐骨神经人NF2-/-原代施万细胞移植瘤模型；C、从小鼠坐骨神经上筛选直径大于1cm的移植瘤；D、分离施万细胞，进行原代细胞培养；E、进行连续5代以上传代培养；F、在筛选获得与人NF2-/-的原代施万细胞、移植瘤原代细胞株细胞形态及主要生物学特征一致，并且能无限传代的NF2-/-前庭神经施旺细胞。肿瘤模型是肿瘤研究的重要载体。研究发现，细胞在传代过程中不断适应体外环境，生物学特点与在体肿瘤细胞不符，细胞系异种移植模型与患者本身肿瘤存在较大一致性，这导致抗肿瘤药物临床试验的失败率高。人源性肿瘤异种移植(patientderivedxenograft，PDX)模型是一种体内模型，通过将病人的新鲜肿瘤组织处理后直接移植到免疫缺陷小鼠上，依靠小鼠提供的环境生长与逐步传代，能以小鼠为载体大量扩增患者肿瘤组织。PDX模型有如下优点：首先，其相当于一个模型对应一个病人，能很好地反应不同个体间肿瘤的差异性，相较于传统模型更能够反应临床病人的实际情况；其次，PDX模型可以进行传代，并且传代的肿瘤组织能够和初始肿瘤组织在基因拷贝数、基因突变和表达模式等保持高度的一致性，相当于对于病人肿瘤样本进行了扩增，这就为药物筛查和病人患病机制研究提供了很好的条件；再次，PDX培养的肿瘤块，可以冻存起来复苏之后依然能够构建新的PDX模型，相当于构建了不同病人的肿瘤活体库。现有的技术主要是通过将新鲜恶性神经鞘瘤组织进行切碎处理或进行细胞匀浆化处理后，在皮下建模。
技术实现思路
但将新鲜的恶性神经鞘瘤组织匀浆处理后被认为破坏了肿瘤组织本身的微环境，不能良好的保持肿瘤与周围间质与患者的一致性。此外，恶性神经鞘瘤来源于神经鞘，相比于皮下建模，原位建模更能良好模拟肿瘤发生环境。本专利成功建立了组织块移植方式，较好的保留了肿瘤与周边间质的稳定关系，成功建立了恶性神经鞘瘤的皮下建模和神经鞘原位建模，保留了模型肿瘤生长环境与患者肿瘤的一致性。因此，本专利技术首先提供一种恶性神经鞘瘤异种移植小鼠模型的构建方法，所述方法包括先采集恶性神经鞘瘤患者肿瘤组织块，再在无菌条件下将新鲜的患者肿瘤组织块异种皮下移植进免疫缺陷小鼠体内，所述异种皮下移植包括选用年龄在2～6周的免疫缺陷小鼠，小鼠性别与患者性别保持一致，将采集到的新鲜的患者肿瘤组织块浸泡在含胎牛血清的无菌孵育液中，小鼠麻醉后固定，将患者肿瘤组织块植入小鼠的皮下，缝合切口，饲养小鼠使得其体内肿瘤生长。本专利技术还提供一种恶性神经鞘瘤异种移植小鼠模型的构建方法，所述方法包括先采集恶性神经鞘瘤患者肿瘤组织块，再在无菌条件下将新鲜的患者肿瘤组织块异种原位移植进免疫缺陷小鼠体内，所述异种原位移植包括选用年龄在2～6周的免疫缺陷小鼠，小鼠性别与患者性别保持一致，将采集到的新鲜的患者肿瘤组织块浸泡在含胎牛血清的无菌孵育液中，小鼠麻醉后固定，将患者肿瘤组织块植入小鼠的神经鞘中，缝合切口，饲养小鼠使得其体内肿瘤生长。在一种具体的实施方式中，所述皮下移植包括在小鼠腋下做皮肤切口，将肿瘤组织植入皮下后缝合手术切口；所述原位移植包括先在小鼠的腋下神经鞘或坐骨神经鞘处作皮肤切口，分离神经鞘并开口，将患者肿瘤组织块植入神经鞘中，然后缝合手术切口。在一种具体的实施方式中，植入小鼠体内的所述恶性神经鞘瘤患者肿瘤组织块的单边长度小于等于3mm，优选小于等于1mm。在一种具体的实施方式中，皮下移植或原位移植时小鼠的体重为8～20g，优选为12～15g，所述无菌孵育液中还包含抗生素，优选所述无菌孵育液中包含抗生素和DMEM培养基或RPMI-1640培养基，更优选所述抗生素包含青霉素和链霉素。在一种具体的实施方式中，所述免疫缺陷小鼠为NOD/SCID小鼠。在一种具体的实施方式中，所述方法还包括采用小动物活体成像仪观察小鼠体内恶性神经鞘瘤大小，优选还采用小动物活体成像仪观察肿瘤是否转移到小鼠的内脏。在一种具体的实施方式中，所述方法还包括饲养小鼠使得其体内肿瘤生长后解剖小鼠，剥离瘤体得到P0代肿瘤瘤体，取P0代肿瘤瘤体异种皮下移植或异种原位移植进免疫缺陷小鼠体内得到P1代肿瘤瘤体，可选地取P1代肿瘤瘤体异种皮下移植或异种原位移植进免疫缺陷小鼠体内得到P2代肿瘤瘤体，以此类推传代；优选所述方法还包括将部分P0代肿瘤瘤体程序降温并保存在液氮中，以及可选地包括将部分P1和P2代肿瘤瘤体程序降温并保存在液氮中。本专利技术还提供一种恶性神经鞘瘤异种移植小鼠模型的构建方法，所述方法包括在无菌条件下将新鲜的小鼠模型中的P0代恶性神经鞘瘤肿瘤组织、P1代恶性神经鞘瘤肿瘤组织或P2代恶性神经鞘瘤肿瘤组织异种皮下移植或异种原位移植进免疫缺陷小鼠体内，所述异种皮下移植或异种原位移植包括选用年龄在2～6周的免疫缺陷小鼠，小鼠性别与患者性别保持一致，将所述恶性神经鞘瘤肿瘤组织块浸泡在含胎牛血清的无菌孵育液中，小鼠麻醉后固定，将所述恶性神经鞘瘤肿瘤组织块植入小鼠皮下或神经鞘中，缝合切口，饲养小鼠使得其体内肿瘤生长。本专利技术还提供一种如上所述方法得到的小鼠模型在筛选预防或治疗恶性神经鞘瘤药物中的应用。本专利技术还提供一种恶性神经鞘瘤异种移植小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括先复苏保存在液氮环境中的恶性神经鞘瘤患者肿瘤组织块，再在无菌条件下将复苏的患者肿瘤组织块异种皮下移植进免疫缺陷小鼠体内，所述异种皮下移植包括选用年龄在2～6周的免疫缺陷小鼠，小鼠性别与患者性别保持一致，将复苏的患者肿瘤组织块浸泡在含胎牛血清的无菌孵育液中，小鼠麻醉后固定，将患者肿瘤组织块植入小鼠的皮下，缝合切口，饲养小鼠使得其体内肿瘤生长。本专利技术还提供一种恶性神经鞘瘤异种移植小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括先复苏保存在液氮环境中的恶性神经鞘瘤患者肿瘤组织块，再在无菌条件下将复苏的患者肿瘤组织块异种原位移植进免疫缺陷小鼠体内，所述异种原位移植包括选用年龄在2～6周的免疫缺陷小鼠，小鼠性别与患者性别保持一致，将复苏的患者肿瘤组织块浸泡在含胎牛血清的无菌孵育液中，小鼠麻醉后固定，将患者肿瘤组织块植入小鼠的神经鞘中，缝合切口，饲养小鼠使得其体内肿瘤生长。...

【技术保护点】
1.一种恶性神经鞘瘤异种移植小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括先复苏保存在液氮环境中的恶性神经鞘瘤患者肿瘤组织块，再在无菌条件下将复苏的患者肿瘤组织块异种皮下移植进免疫缺陷小鼠体内，所述异种皮下移植包括选用年龄在2～6周的免疫缺陷小鼠，小鼠性别与患者性别保持一致，将复苏的患者肿瘤组织块浸泡在含胎牛血清的无菌孵育液中，小鼠麻醉后固定，将患者肿瘤组织块植入小鼠的皮下，缝合切口，饲养小鼠使得其体内肿瘤生长。/n

【技术特征摘要】
1.一种恶性神经鞘瘤异种移植小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括先复苏保存在液氮环境中的恶性神经鞘瘤患者肿瘤组织块，再在无菌条件下将复苏的患者肿瘤组织块异种皮下移植进免疫缺陷小鼠体内，所述异种皮下移植包括选用年龄在2～6周的免疫缺陷小鼠，小鼠性别与患者性别保持一致，将复苏的患者肿瘤组织块浸泡在含胎牛血清的无菌孵育液中，小鼠麻醉后固定，将患者肿瘤组织块植入小鼠的皮下，缝合切口，饲养小鼠使得其体内肿瘤生长。


2.一种恶性神经鞘瘤异种移植小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括先复苏保存在液氮环境中的恶性神经鞘瘤患者肿瘤组织块，再在无菌条件下将复苏的患者肿瘤组织块异种原位移植进免疫缺陷小鼠体内，所述异种原位移植包括选用年龄在2～6周的免疫缺陷小鼠，小鼠性别与患者性别保持一致，将复苏的患者肿瘤组织块浸泡在含胎牛血清的无菌孵育液中，小鼠麻醉后固定，将患者肿瘤组织块植入小鼠的神经鞘中，缝合切口，饲养小鼠使得其体内肿瘤生长。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对采集到的恶性神经鞘瘤患者肿瘤组织块进行程序降温和液氮保存的过程以及快速升温复苏的过程。


4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述恶性神经鞘瘤患者肿瘤组织块保存在含DMSO、FBS和NEAA的DMEM中，三段以上程序降温至液氮温度，并在液氮温度中保存，所述快速升温复苏是指将冻存组织放至36～38℃的恒温水浴中进行复苏。


5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述皮下移植包括在小鼠腋下做皮肤切口，将肿瘤组织植入皮下后缝合手术切口；所述原位移植包括先在小鼠的腋下神经鞘或坐骨神经鞘处作皮肤切口，分离神经鞘并开口，将患者肿瘤组织块植入神经鞘中，然后缝合手术切口。


6.根据权利要求1或2...

【专利技术属性】
技术研发人员：黎志宏，万璐，刘忠越，段智曦，张程豪，罗煦君，
申请(专利权)人：中南大学湘雅二医院，
类型：发明
国别省市：湖南;43