一种樟叶越桔悬浮细胞培养体系的建立方法技术

本发明专利技术公开一种樟叶越桔悬浮细胞培养体系的建立方法，属于植物细胞工程领域。本发明专利技术所述方法，本发明专利技术所述方法以樟叶越桔组培苗的幼嫩叶为外植体，将处理好的幼嫩叶放入诱导培养基中诱导出愈伤组织，将愈伤组织转移到增殖培养基中，生长成适合悬浮培养的状态，将适宜的愈伤组织转移到液体培养基中，成为稳定的悬浮培养体系。本发明专利技术所述方法可以根据实际生产选择相应的培养组合进行生产，从而降低生产成本，提高效率，为工厂化生产樟叶越桔悬浮培养体系提供指导依据。

A method of establishing suspension cell culture system of camphor bilberry

【技术实现步骤摘要】
一种樟叶越桔悬浮细胞培养体系的建立方法
本专利技术涉及一种樟叶越桔悬浮细胞培养体系的建立方法，属于植物细胞工程领域。
技术介绍
樟叶越桔(Vacciniumdunalianum)为杜鹃花科(Ericaceae)越桔属(Vaccinium)常绿灌木，主要分布于云南西北部经滇中高原至滇南和滇东。其果实营养丰富，全株具有舒筋活络、祛风除湿等功效，具有较高的药用和保健价值。此外，樟叶越桔也是一种富含咖啡酰熊果苷类物质的特殊资源植物，其主要成分的黑色素生成抑制活性优于熊果苷，且毒性仅为熊果苷的1/2，可作为熊果苷天然替代资源加以开发利用。樟叶越桔目前仍处于野生状态，由于连年遭受破坏性采摘，导致其野生资源急剧减少，因此利用生物技术手段建立其培养体系具有重要意义。植物细胞培养包括通过植物幼胚、原生质体、细胞、组织、器官的培养，生产重要的次生代谢产物、新的植物个体(种苗的快速繁殖)，以及进行植物细胞生理生化和遗传学研究的一个工程学和生物学相结合的交叉学科。近年来植物细胞培养以其独特的优势，越来越收到科学家的青睐，首先，细胞培养过程可以在培养皿中连续、均匀的进行，不会受到气候、病虫害等外界因素的影响；其次，培养过程可以在生物反应器中大规模进行，可以人为的对反应条件进行控制，提高目标产物的得率。近年来，国内学者利用细胞悬浮培养技术在人参(Panaxginseng)、西洋参(P.quinquefolius)、三七(P.notoginseng)、紫草(Lithospermumerythrorhizon)、红豆杉(Taxuschinensis)、雪莲(Saussureainvolucrata)和银杏(Ginkgobiloba)等药用植物次生代谢产物的生产调控上开展了许多研究，但细胞悬浮培养技术在樟叶越桔植物上的应用尚未见报道。本专利技术以樟叶越桔组培苗幼嫩叶为材料研究了愈伤组织的诱导及增殖条件，建立了樟叶越桔的细胞悬浮培养体系，以期进一步为樟叶越桔中咖啡酰熊果苷类物质的生产调控奠定基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种樟叶越桔悬浮细胞培养体系的建立方法，使用樟叶越桔组培苗的幼嫩叶诱导愈伤组织并建立细胞悬浮培养体系，该方法生产成本低，效率高，为工厂化生产樟叶越桔悬浮培养体系提供指导依据。进一步的，本专利技术所述樟叶越桔悬浮细胞培养体系的建立方法，具体包括以下步骤：(1)愈伤组织的诱导：切取樟叶越桔组培苗的幼嫩叶片，将叶片的正面或者背面划上条形伤口，将叶片的背面紧贴诱导培养基生长，诱导出愈伤组织；所述诱导培养基为WPM基本培养基与细胞生长素的组合：WPM+1.0～2.0mg/L6-BA+0.05～1.0mg/LNAA+1.0～2.0mg/L2,4-D+28～42g/L蔗糖+4.5～5.3g/L琼脂。本专利技术培养基中1.0～2.0mg/L6-BA指1L的WPM基本培养基中加入1.0～2.0mg的6-BA，28～42g/L蔗糖是指1L的WPM基本培养基中加入30g蔗糖，本专利技术中其他添加剂的表述的含义同上。(2)愈伤组织的增殖：挑选挑选无褐化、生长旺盛的愈伤组织，转移至WPM增殖培养基中培养，生长成适合悬浮培养的状态；所述WPM增殖培养基为WPM基本培养基与细胞生长素的组合：WPM+1.0～2.0mg/LZT+0.2～0.6mg/LNAA+28～42g/L蔗糖+4.5～5.3g/L琼脂。(3)悬浮体系的建立：挑选生长旺盛的半透明愈伤组织转移至液体培养基中(愈伤组织一般呈现暗黄色，半透明，能自行分散成近粉末状的愈伤颗粒适宜在液体培养基中生长，将此状态的愈伤组织转移至液体培养基，稍加碾压使其尽量分散)，培养7～10天后去掉大颗粒的愈伤组织，筛选后的小颗粒愈伤组织用无菌水充分清洗后，转移至新鲜的液体培养基中培养，形成稳定的悬浮培养体系，分离得到悬浮培养细胞Ⅰ；所述培养基为WPM培养基与细胞生长素的组合：WPM培养基+1.5～2.5mg/LZT+0.3～0.6mg/LNAA+28～42g/L蔗糖。优选的，本专利技术步骤(1)中培养条件为：25±2℃，光照强度30-50μmol/m2·s，光照周期10～12h/d，培养时间为50～60d，长出的愈伤组织呈现出半透明，活性较强的优良状态。优选的，本专利技术步骤(2)中愈伤组织的增殖的条件为：25±2℃，暗培养，培养时长70～90d；长出的愈伤组织除呈现半透明蓬松状态，还能在边缘处出现能自行分散成小颗粒的愈伤，此状态下的愈伤组织符合悬浮培养体系的要求。优选的，本专利技术步骤(3)中培养条件为：25±2℃，暗培养，培养基pH值为4.8～5.2，摇床转速为120～160rpm/min，培养时长7～10d。优选的，本专利技术步骤(3)中大小颗粒筛选过程为：用40～60目不锈钢筛过滤，筛下组织即为小颗粒愈伤组织。优选的，本专利技术步骤(3)中WPM培养基替换为3/5有机的改良WPM培养基。本专利技术所述WPM全称是WPM木本植物基本培养基，其中包括了大量元素(硝酸铵400mg/L、硫酸钾990mg/L、硫酸镁370mg/L、磷酸二氢钾170mg/L)；钙盐(硝酸钙684mg/L)；微量元素(硫酸锰22.5mg/L、硫酸锌8.6mg/L、硼酸6.2mg/L、硫酸铜0.25mg/L、钼酸钠0.25mg/L)；铁盐(硫酸亚铁27.8mg/L、乙二胺四乙酸37.3mg/L)；3/5有机四样(盐酸硫胺素1mg/L、盐酸吡哆锌0.5mg/L、烟酸0.5mg/L、甘氨酸2mg/L)；肌醇(100mg/L)；本专利技术所述改良培养基，是指相较于正常的WPM培养基，有机四样的含量只有普通的3/5。根据实际需要，还可以进行悬浮体系的继代：将步骤(3)中的正常生长的愈伤组织在培养完成后，使用40～60目不锈钢筛过滤掉原液体培养基，并用无菌纸吸去水分，转移至新鲜的3/5有机的改良WPM培养基中培养，形成稳定的悬浮培养体系，分离得到悬浮培养细胞Ⅱ(用180～200目不锈钢筛过滤，180～200目以上组织即为本专利技术所需的适宜悬浮培养体系的小颗粒愈伤组织，记为悬浮培养细胞Ⅱ)；所述培养基为3/5有机的改良WPM培养基与细胞生长素的组合：3/5有机的改良WPM培养基+1.0～2.0mg/LZT+0.1～0.2mg/LNAA+28～42g/L蔗糖；培养条件为：25±2℃，暗培养，培养时长7～10d，培养基pH值为4.8～5.2，摇床转速为120～160rpm/min，培养基体积为40～50mL，接种量为20～40g/L。进一步的，根据实际需要，还可以对培养悬浮培养体系进行改良，然后继续培养，包括两种方法：方法一为：悬浮培养细胞Ⅰ过180～200目筛，保留筛子上部的组织，用无菌滤纸吸干水分，接种至3/5有机的改良WPM培养基中，继续培养；所述培养基为WPM固体基本培养基与细胞生长素的组合：3/5有机的改良WPM培养基+1.0～2.0mg/LZT+0.1～0.2mg/LNAA+28～42g/L蔗糖；培养条件为：25±2℃，暗培本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种樟叶越桔悬浮细胞培养体系的建立方法，其特征在于：使用樟叶越桔组培苗的幼嫩叶诱导愈伤组织并建立细胞悬浮培养体系。/n

【技术特征摘要】
1.一种樟叶越桔悬浮细胞培养体系的建立方法，其特征在于：使用樟叶越桔组培苗的幼嫩叶诱导愈伤组织并建立细胞悬浮培养体系。


2.根据权利要求1所述樟叶越桔悬浮细胞培养体系的建立方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)愈伤组织的诱导：切取樟叶越桔组培苗的幼嫩叶片，将叶片的正面或者背面划上条形伤口，将叶片的背面紧贴诱导培养基生长，诱导出愈伤组织；
所述诱导培养基为WPM基本培养基与细胞生长素的组合：WPM+1.0～2.0mg/L6-BA+0.05～1.0mg/LNAA+1.0～2.0mg/L2,4-D+28～42g/L蔗糖+4.5～5.3g/L琼脂；
(2)愈伤组织的增殖：挑选无褐化、生长旺盛的愈伤组织，转移至WPM增殖培养基中培养，生长成适合悬浮培养的状态；
所述WPM增殖培养基为WPM基本培养基与细胞生长素的组合：
WPM+1.0～2.0mg/LZT+0.2～0.6mg/LNAA+28～42g/L蔗糖+4.5～5.3g/L琼脂；
(3)悬浮体系的建立：挑选生长旺盛的半透明愈伤组织转移至液体培养基中，培养7～10d后去掉大颗粒的愈伤组织；筛选后的小颗粒愈伤组织用无菌水充分清洗后，转移至新鲜的液体培养基中培养，形成稳定的悬浮培养体系，分离得到悬浮培养细胞Ⅰ；
所述培养基为WPM培养基与细胞生长素的组合：WPM培养基+1.5～2.5mg/LZT+0.3～0.6mg/LNAA+28～42g/L蔗糖。


3.根据权利要求2所述樟叶越桔悬浮细胞培养体系的建立方法，其特征在于：步骤(1)中培养条件为：25±2℃，光照强度30-50μmol/m2·s，光照周期10～12h/d，培养时间为50～60d。


4.根据权利要求2所述樟叶越桔悬浮细胞培养体系的建立方法，其特征在于：步骤(2)中愈伤组织的增殖的条件为：25±2℃，暗培养，培养时长70～90d。


5.根据权利要求2所述樟叶越桔悬浮细胞培养体系的建立方法，其特征在于：步骤(3)中培养条件为：25±2℃，暗培养，培养基pH值为4.8～5.2，摇床转速为120～160rpm/min，小颗粒愈伤组织培养时长7～10d。


6.根据权利要求2所述樟叶越桔悬浮细胞培养体系的建立方法，其特征在于：步骤(3)中大小颗粒筛选过程为：用40～60目不锈钢筛过滤，筛下组织即为小颗粒愈伤...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵平，唐军荣，刘云，阚欢，付羚，罗旭璐，张訸，
申请(专利权)人：西南林业大学，
类型：发明
国别省市：云南;53