固定化酶催化法合成D-木酮糖制造技术

本发明专利技术公开了固定化酶催化法合成D‑木酮糖，该方法从廉价的D‑木糖和D‑木糖醇出发，克隆了代谢途径中相关的系列酶基因，发酵生产系列酶，经过纯化和固定，然后加入相关起始原料，合成D‑木酮糖。本发明专利技术采用固定化酶法，以廉价的木糖和木糖醇为原料高收率转化成D‑木酮糖；通过与木酮糖激酶的偶合催化不仅实现了原料的转化完全，并且大大的方便了后期产品纯化，而固定化酶的应用则进一步降低了生产成本并有利于规模化工业生产。

Catalytic synthesis of D-xylose by immobilized enzyme

【技术实现步骤摘要】
固定化酶催化法合成D-木酮糖
本专利技术涉及固定化酶催化法合成D-木酮糖，具体涉及利用固定化酶多步催化将D-木糖和D-木糖醇转化成D-木酮糖的方法。
技术介绍
D-木酮糖(D-Xylulose)是一种五碳酮糖，分子式为C5H10O5，分子量为150；它是自然界广泛存在的木糖(D-xylose)代谢的重要中间产物，通过与相应激酶作用转化成磷酸木糖而后进入通用的磷酸戊糖代谢路径。D-木酮糖在人体的尿液、血液、脑脊髓液等部位被检测出较高浓度，且发挥着有待探索的未知功能。与此同时，D-木酮糖通过脱水反应能较为方便地转化成糠醛(furfural)，糠醛是当今热门研究的一种可再生的生物能源及生物化工产品的起始原料，具有极大地市场发展前景。市面上昂贵的价格(￥16000/克,Carbosynth公司)极大地限制了D-木酮糖在研究领域及工业应用领域的进一步发展，因此开发一种利用廉价原料(D-木糖:￥380/公斤；木糖醇:￥555/公斤,aladdin试剂)、简易可放大的制备方法以降低其市场价格显得比较重要。D-木酮糖常规制备方法有提取法、化学合成法及发酵法。但由于自然界中D-木酮糖丰度并不高，且极性大、水溶性高并混有很多类似糖分，因此分离提取纯化方法成本高，该方法仅存在于早期D-木酮糖的研究中；后来随着糖化学制备工艺的逐渐成熟,木酮糖也逐渐实现利用廉价的木糖醇选择性氧化合成，然而由于木糖醇上多个羟基的存在，该方法中底物-OH的选择性保护、氧化、脱保护使得整个合成工艺繁琐复杂，生产成本居高不下。由于无需考虑糖类化合物上的多个手性中心，酶法或发酵法制备该类化合物具有其独特的优势，日本的Ajinomoto公司利用一种葡糖杆菌属(Gluconobacter)的酵母，以阿拉伯糖醇(D-Arabitol)为原料发酵生产D-木酮糖(US6221634B1)，但是由于产品中混有木糖醇、木糖等其它类似单糖杂质导致最终纯化成本高。
技术实现思路
为了克服现有技术无法低成本地、便捷地制备高纯度D-木酮糖的缺陷，本专利技术的目的在于提供固定化酶催化法合成D-木酮糖。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种合成D-木酮糖的方法，包括以下步骤：(1)PCR扩增木糖异构酶(XI)、木糖醇氧化酶(XDH)、木酮糖激酶(XK)、ATP再生酶(PPK)、乳酸脱氢酶(LDH)以及磷酸水解酶(AP)的基因片段，将所得基因片段分别连接到质粒上，转入细胞中；细胞做抗性筛选，然后逐级扩大培养并诱导蛋白表达，分别收集含有上述各种酶的湿细胞；所述的PCR扩增，是以大肠杆菌(EscherichiacoliDH5a)菌株gDNA、包皮垢分支杆菌(MycobacteriumsmegmatisATCC700084)染色体为模板；所述的质粒优选pET28a；所述的细胞优选E.coliBL21(DE3)菌株；步骤(1)中，所述做抗性筛选和扩大培养采用的培养基都是LB液体培养基；做抗性筛选的培养基中还含有50μM卡那霉素；所述的扩大培养，培养基中含有0.5mMIPTG，37℃诱导表达6小时；(2)将收集的湿细胞高压破碎、离心，在上清液中逐量加入硫酸铵直至蛋白固体析出；离心收集蛋白，纯化，分别得到XI、XDH、XK、LDH、PPK、AP液体酶；所述的离心，是10000-16000rpm离心10-45min；所述的纯化，是将蛋白溶解到pH值8.0的Tris缓冲液中，然后在同样的缓冲液中做透析处理，最后经DEAESepliteFF阴离子交换柱分离，得到纯化的液体酶；(3)将XI、XK、PPK按活性单位比1.0:(1.5～3.0):(3.0～6.0)溶解在缓冲液中，随后加入环氧树脂，室温搅拌8小时以上，酶固定在环氧树脂上，固定化酶具有30-70％的初始活力；该步骤中，三种酶的稳定性有差别，XI稳定性很高，并且是平衡反应；为实现转化完全，后面两步酶要分别过量。XI反应易进行，酶稳定性较好，用量最少。XK相对不容易些，要实现其有效转化，PPK再生ATP很关键；通过这种组合能实现后步反应快速拖动前面XI的平衡反应，从而实现产品的快速、流畅转化。将XDH、XK、PPK、LDH四种酶按活性单位比(1.5-2.5):(1.5-3.0):(3.0-6.0):(1.0-2.0)混合，依上述同样的步骤固定在环氧树脂上，固定化酶具有20-45％的初始活力；和上文类似，几个酶的比例要调节合适才能实现体系的快速转化。和上面不同的是，XDH稳定性比XI要差不少，所以其用量要加大，并且还多了LDH再生NAD+，但是该步反应效率很高，酶稳定性也好，其用量可以适当降低。XK与PPK比例与上述一致即可。AP依上述同样的步骤单独固定，固定化后保留90％的液体酶活；所述的缓冲液优选pH值8.0的磷酸钾溶液；(4)在缓冲液中加入D-木糖、三磷酸腺苷二钠盐、多聚磷酸、氯化镁和氯化钾，调节pH值到6.5–8.5，加入固定化混合酶(XI、XK、PPK)，维持体系pH值在6.5-8.5，30℃搅拌3-5小时，过滤回收固定化酶(回收活性在50-85％)，所得D-木酮糖-5-磷酸粗液进行纯化；在缓冲液中加入D-木糖醇、丙酮酸钠、三磷酸腺苷二钠盐、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸单钠盐、多聚磷酸、氯化镁和氯化钾，调节pH值到6.0-9.0，加入固定化混合酶(XDH、XK、LDH、PPK)，维持体系pH值在6.0-9.0，30℃搅拌2.5-5.5小时，过滤回收固定化酶(回收活性在55-85％)，所得D-木酮糖-5-磷酸粗液进行纯化；所述的缓冲液优选pH值8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液；所述的D-木酮糖-5-磷酸粗液进行纯化，包括以下步骤：往过滤液中加入木糖或木糖醇1.1当量的草酸钡并搅拌充分，随后混入两倍过滤液体积的乙醇溶液沉淀所有含磷酸成分(含D-木酮糖-5-磷酸、AMP、ADP、ATP)，离心收集沉淀并将之溶解在pH值1.0的Tris缓冲溶液中，再加入草酸钡等当量的无水硫酸钠，离心除去BaSO4沉淀，调节上清液pH值至7.0，用D201阴离子交换树酯除去腺苷杂质(利用0～1N的碳酸氢氨水溶液梯度洗脱)，最后G25尺寸排阻柱脱盐(去离子水做洗脱液)、冻干得到白色固体即为D-木酮糖-5-磷酸钠纯品；(5)将D-木酮糖-5-磷酸钠和氯化镁加入缓冲液中，再加入固定化AP，20-40℃反应1.5-3.5个小时，然后过滤回收固定化AP(具有92％初始活性)，反应液过阴离子交换树酯除去含磷酸杂质，D-核酮糖最先被洗脱出；最后经纯化得到D-木酮糖纯品；步骤(5)所述的缓冲液优选pH值7.0的Tris.HCl溶液；所述的纯化是G25尺寸排阻柱脱盐。本专利技术方法所涉及的代谢途径如下式所示：木糖异构酶(XI,EC5.3.1.5)能将D-木糖转化成D-木酮糖，但由于该平衡反应的不完全，反应液中大量残留的木糖原料极大地妨碍了木酮糖的纯化。D-木酮糖激本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种合成D-木酮糖的方法，其特征在于包括以下步骤：/n(1)PCR扩增木糖异构酶、木糖醇氧化酶、木酮糖激酶、ATP再生酶、乳酸脱氢酶以及磷酸水解酶的基因片段，将所得基因片段分别连接到质粒上，转入细胞中；细胞做抗性筛选，然后逐级扩大培养并诱导蛋白表达，分别收集含有上述各种酶的湿细胞；/n(2)将收集的湿细胞高压破碎、离心，在上清液中逐量加入硫酸铵直至蛋白固体析出；离心收集蛋白，纯化，分别得到XI、XDH、XK、LDH、PPK、AP液体酶；/n(3)将XI、XK、PPK按活性单位比1.0:(1.5～3.0):(3.0～6.0)溶解在缓冲液中，随后加入环氧树脂，室温搅拌8小时以上，将酶固定在环氧树脂上；/n将XDH、XK、PPK、LDH四种酶按活性单位比(1.5-2.5):(1.5-3.0):(3.0-6.0):(1.0-2.0)混合，依上述同样的步骤固定在环氧树脂上；/nAP依上述同样的步骤单独固定；/n(4)在缓冲液中加入D-木糖、三磷酸腺苷二钠盐、多聚磷酸、氯化镁和氯化钾，调节pH值到6.5–8.5，加入固定化混合酶(XI、XK、PPK)，维持体系pH值在6.5-8.5，30℃搅拌3-5小时，过滤回收固定化酶，所得D-木酮糖-5-磷酸粗液进行纯化；/n在缓冲液中加入D-木糖醇、丙酮酸钠、三磷酸腺苷二钠盐、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸单钠盐、多聚磷酸、氯化镁和氯化钾，调节pH值到6.0-9.0，加入固定化混合酶(XDH、XK、LDH、PPK)，维持体系pH值在6.0-9.0，30℃搅拌2.5-5.5小时，过滤回收固定化酶，所得D-木酮糖-5-磷酸粗液进行纯化；/n(5)将D-木酮糖-5-磷酸钠和氯化镁加入缓冲液中，再加入固定化AP，20-40℃反应1.5-3.5个小时，然后过滤回收固定化AP，反应液过阴离子交换树酯除去含磷酸杂质，D-核酮糖最先被洗脱出；最后经纯化得到D-木酮糖纯品。/n...

【技术特征摘要】
1.一种合成D-木酮糖的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)PCR扩增木糖异构酶、木糖醇氧化酶、木酮糖激酶、ATP再生酶、乳酸脱氢酶以及磷酸水解酶的基因片段，将所得基因片段分别连接到质粒上，转入细胞中；细胞做抗性筛选，然后逐级扩大培养并诱导蛋白表达，分别收集含有上述各种酶的湿细胞；
(2)将收集的湿细胞高压破碎、离心，在上清液中逐量加入硫酸铵直至蛋白固体析出；离心收集蛋白，纯化，分别得到XI、XDH、XK、LDH、PPK、AP液体酶；
(3)将XI、XK、PPK按活性单位比1.0:(1.5～3.0):(3.0～6.0)溶解在缓冲液中，随后加入环氧树脂，室温搅拌8小时以上，将酶固定在环氧树脂上；
将XDH、XK、PPK、LDH四种酶按活性单位比(1.5-2.5):(1.5-3.0):(3.0-6.0):(1.0-2.0)混合，依上述同样的步骤固定在环氧树脂上；
AP依上述同样的步骤单独固定；
(4)在缓冲液中加入D-木糖、三磷酸腺苷二钠盐、多聚磷酸、氯化镁和氯化钾，调节pH值到6.5–8.5，加入固定化混合酶(XI、XK、PPK)，维持体系pH值在6.5-8.5，30℃搅拌3-5小时，过滤回收固定化酶，所得D-木酮糖-5-磷酸粗液进行纯化；
在缓冲液中加入D-木糖醇、丙酮酸钠、三磷酸腺苷二钠盐、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸单钠盐、多聚磷酸、氯化镁和氯化钾，调节pH值到6.0-9.0，加入固定化混合酶(XDH、XK、LDH、PPK)，维持体系pH值在6.0-9.0，30℃搅拌2.5-5.5小时，过滤回收固定化酶，所得D-木酮糖-5-磷酸粗液进行纯化；
(5)将D-木酮糖-5-磷酸钠和氯化镁加入缓冲液中，再加入固定化AP，20-40℃反应1.5-3.5个小时，然后过滤回收固定化AP，反应液过阴离子交换树酯除去含磷酸杂质，D-核酮糖最先被洗脱出；最后经纯化得到D-木酮糖纯品。...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄华，张传封，张兴锟，
申请(专利权)人：华南师范大学，
类型：发明
国别省市：广东;44