一种液滴数字PCR芯片及其使用方法技术

本发明专利技术设计了一种液滴数字PCR芯片，集成了液滴形成、扩增与检测三个功能单元。其中，芯片液滴形成单元包含油孔、PCR试剂孔及相应管道，油孔管道与PCR试剂孔管道形成十字交叉；芯片扩增单元为蛇形管道；芯片检测单元包括动态检测位和静态检测位，所述动态检测位为管道，与光学检测模块配套，实时检测完成扩增的液滴；所述静态检测位收集所有扩增后的液滴，利用CCD相机同时检测阳性扩增。

A drop digital PCR chip and its application

【技术实现步骤摘要】
一种液滴数字PCR芯片及其使用方法
本专利技术涉及数字PCR
，尤其涉及一种集液滴形成、扩增与检测一体化的微流控芯片。
技术介绍
PCR技术作为一种核酸体外扩增技术，具有特异性强，灵敏度高，快速简便，重复性好，所需模板量少等优点，已广泛应用于法医检测，临床诊断，分子生物学研究等领域。PCR的基本原理是模仿DNA的天然复制过程，依赖寡核苷酸引物和模板的特异性互补，经过多次变性-退火-延伸的温度循环过程，实现目标片段的指数级扩增。数字PCR技术是一种新的核酸检测和定量技术，与传统定量PCR技术不同，数字PCR采用绝对定量的方式，不依赖于标准曲线和参照样本，直接检测目标序列的拷贝数。由于这种检测方式具有比传统qPCR更加出色的灵敏度、特异性和精确性而得到广泛应用。这项技术在极微量核酸样本检测、复杂背景下稀有突变检测和表达量微小差异鉴定方面表现出的优势已被普遍认可，而其在基因表达研究、microRNA研究、基因组拷贝数鉴定、癌症标志物稀有突变检测、致病微生物鉴定、转基因成分鉴定、NGS测序文库精确定量和结果验证等诸多方面具有的广阔应用前景已经受到越来越多的关注。数字PCR采用的策略非常简单，就是分而治之，将一个标准PCR反应体系平均分配到大量微小的反应器中，在每个反应器中包含或不包含一个或多个拷贝的目标分子(DNA模板)，实现“单分子模板PCR扩增”。常见的分液方法包括液滴法和网格法。液滴法是利用油和表面活性剂包裹PCR试剂形成大小均一的液滴，而网格法是在芯片上制造微小的孔道实现分液。扩增结束后，通过“发光”反应器的数目计算目标序列的拷贝数，因此无需依赖于对照样品和标准曲线就可以进行精确的绝对定量；此外，由于数字PCR在进行结果判读时仅判断有/无两种扩增状态，因此也不需要检测荧光信号与设定阈值线的交点，完全不依赖于Ct值的鉴定，因此数字PCR的反应受扩增效率的影响大大降低，对PCR反应抑制物的耐受能力大大提高；数字PCR实验中标准反应体系分配的过程可以极大程度上降低与目标序列有竞争性作用的背景序列浓度，因此数字PCR技术也特别适合在复杂背景中检测稀有突变。微流控芯片技术是在微尺度空间下利用高度集成的功能单元实现多步骤的生化反应过程，减少人工操作，实现样品入-结果出（Samplein-Answerout），为生物医学诊断、分析化学、生命科学等领域提供自动化解决方案。微流控芯片的优势在于减小反应体系和所需试剂用量，自动化控制减少人工操作过程，提高操作的一致性。目前，市场上的主流数字PCR产品包括Bio-Rad公司的QX100和QX200；RainDance公司的RainDrop；Fluidigm公司的Bio-MarkHD系统和ThermoFisherScientific公司的QuantStudio系统。上述产品通常包含2个以上设备——分液（及扩增）设备和结果读取设备。增加了人工操作步骤且带来扩增产物暴露的风险。为了解决该问题，本专利技术设计了一种一体化芯片，集成液滴形成、扩增与检测功能。
技术实现思路
本专利技术设计了一种液滴数字PCR芯片，集成了液滴形成、扩增与检测三个功能单元。芯片设计简单化，不需要复杂结构和微阀，降低加工难度易于生产。同时，还提供所述液滴数字PCR芯片的使用方法。本专利技术第一个方面提供一种液滴数字PCR芯片。本专利技术第一个方面所述的一种液滴数字PCR芯片集成了液滴形成、扩增与检测三个功能单元；其中，芯片液滴形成单元包含油孔（1）、PCR试剂孔（2）及相应管道（3、4），油孔管道与PCR试剂孔管道形成十字交叉（5）；芯片扩增单元为蛇形管道（6）；芯片检测单元包括动态检测位（7）和静态检测位（8），所述动态检测位（7）为管道，所述静态检测位为方形仓（8）；另外，芯片上含有通气孔（9）。优选的，上述芯片由盖片和基片组成，盖片上至少包含1个PCR试剂孔（2）和1个油孔（1），所述基片上包含仓室及管道。优选的，芯片的扩增单元与外部温控系统耦合，形成温度梯度带。优选的，芯片采用流动式扩增方法，PCR液滴形成后顺序流经扩增区域的蛇形管道（6），实现扩增过程，管道的直径只允许每次通过一个液滴。扩增方式包括等温扩增和变温扩增。在等温扩增中外部温控系统保持恒温，生成的PCR液滴可以匀速通过蛇形管道所在的恒温区域。在变温扩增中蛇形管道（6）对称的两端分别为变性温度区和退火及延伸温度区，通过调整流速可控制液滴通过相应温度区的时间。优选的，芯片表面透明，制作材料选用PS、PC、COC、COP、PMMA、PTFE或PDMS的一种或多种组合。优选的，该芯片可形成2万至2千万个PCR液滴，液滴尺寸为2皮升至0.2毫升，更为优选的，可形成2万至1千万个PCR液滴，液滴尺寸为5皮升至0.1毫升。优选的，可用两种方法检测扩增结果，包括动态检测和静态检测。动态检测指在动态检测位（7）配套光学检测模块（10），实时检测完成扩增的液滴，静态检测指在静态检测位（8）收集所有扩增后的液滴，利用CCD相机（11）同时检测。本专利技术另一个方面提供一种液滴数字PCR芯片的使用方法，如下：（a）在PCR试剂孔（2）和油孔（1）中注入相应试剂；（b）在PCR试剂孔（2）和油孔（1）上加盖密封垫；（c）驱动试剂孔和油孔中的液体流动至十字交叉（5）处，形成大小均一的PCR反应液滴；（d）PCR反应液滴依次流经扩增的蛇形管道（6），完成扩增反应；（e）在动态检测位（7）实时计数阳性液滴，或待扩增反应全部完成后在静态检测位（8）同时检测阳性液滴。本专利技术的有益之处在于利用微流控芯片集成了液滴数字PCR技术中的液滴形成、扩增与检测计数三个功能，形成封闭系统，避免扩增后产物污染。微流控芯片设计简单化，不需要复杂结构和微阀，降低成本及批量生产的难度。同时，降低外部控制系统的复杂度，可应用于小型自动化设备中。附图说明图1为本专利技术一种液滴数字PCR芯片结构示意图图2为本专利技术一种液滴数字PCR芯片扩增结果检测方法示意图其中附图标记：1、油孔，2、PCR试剂孔，3、管道一，4、管道二，5、十字交叉，6、蛇形管道，7、动态检测位，8、静态检测位，9、通气孔，10、光学检测模块，11、CCD相机。具体实施方式接下来将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是示例性的，决不作为对本专利技术及其应用或使用的任何限制。同时，为了便于描述，附图中所示的各个部分的尺寸并不是按照实际的比例关系绘制的。实施例1。一种液滴数字PCR芯片集成了液滴形成、扩增与检测三个功能单元，如图1和图2所示。其中，芯片液滴形成单元包含1个油孔（1）、1个PCR试剂孔（2）及油孔管道一（3）和管道二（4）。油孔管道一（3）与管道二（4）与PCR试剂孔管道形成十字交叉（5）；芯片扩增单元为蛇形管道（6）；芯片检测采用动态检测位（7），此时静态检测位（8）可用作储存检测之后的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种液滴数字PCR芯片，其特征在于，集成了液滴形成、扩增与检测三个功能单元；/n所述芯片液滴形成单元包含油孔、PCR试剂孔及相应管道，油孔管道与PCR试剂孔管道形成十字交叉；/n所述芯片扩增单元为蛇形管道；/n所述芯片检测单元包括动态检测位和静态检测位，所述动态检测位为管道，所述静态检测位为方形仓；/n所述芯片上含有通气孔。/n

【技术特征摘要】
1.一种液滴数字PCR芯片，其特征在于，集成了液滴形成、扩增与检测三个功能单元；
所述芯片液滴形成单元包含油孔、PCR试剂孔及相应管道，油孔管道与PCR试剂孔管道形成十字交叉；
所述芯片扩增单元为蛇形管道；
所述芯片检测单元包括动态检测位和静态检测位，所述动态检测位为管道，所述静态检测位为方形仓；
所述芯片上含有通气孔。


2.如权利要求1所述的一种液滴数字PCR芯片，其特征在于，所述芯片由盖片和基片组成，所述盖片上至少包含1个PCR试剂孔和1个油孔，所述基片上包含仓室及管道。


3.如权利要求1所述的一种液滴数字PCR芯片，其特征在于，芯片的扩增单元与外部温控系统耦合，形成温度梯度带。


4.如权利要求1所述的一种液滴数字PCR芯片，其特征在于，采用流动式扩增方法，PCR液滴形成后顺序流经扩增区域的蛇形管道，实现扩增过程。


5.如权利要求4所述的一种液滴数字PCR芯片，其特征在于，所述扩增过程包括等温扩增和变温扩增。


6.如权利要求1所述的一种液滴数字PCR芯片，其特征在于，所述芯片表面透明，制...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡亦梅，高静，范东雨，李洁昆，张瑜，任鲁风，
申请(专利权)人：北京中科生仪科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11