本申请公开一种拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因功能性分子标记，所述分子标记为SEQ ID No.1所示的序列。一种重组表达载体，其包含如前所述的拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因功能性分子标记的序列。如前所述的拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因功能性分子标记在验证植物植株发育状态中,或者在叶片发育状态中的应用。本申请拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因功能性分子标记可快速验证植株或植株叶片的发育状态，操作简单易行，实验结果可靠。应用该分子标记可以便利地进行植株发育的研究。
【技术实现步骤摘要】
拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因功能性分子标记及其应用
本申请涉及一种基因工程领域，尤其涉及一种拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因功能性分子标记及其应用。
技术介绍
植物叶片的锯齿状边缘是一种在遗传和环境方面受到调节的形态特征，在野生型的拟南芥叶中，锯齿仅限于叶的基部。拟南芥中的叶片形状通过利用基于PIN的生长素输出蛋白/CUC2转录因子系统的边缘中的图案化事件来调节，以定义促进和延迟生长的区域，从而产生形态发生。然而植物叶片的锯齿状边缘的发生难以通过肉眼分辨。TCP(TEOSINTEBRANCHED/CYCLOIDEA/PROLIFERRATINGCELLFACTORS)是一种含有TCP结构域的植物特异性转录因子基因，可以编码具有bHLH基序的植物特异性转录因子，该基序允许DNA结合和蛋白质-蛋白质相互作用。TCP5是TCP转录因子家族Ⅱ类基因成员之一，可以促进在器官生长过程中从细胞分裂到体积扩增再到细胞分化的过渡，从而调节器官最终的大小和形状。
技术实现思路
本申请的目的是，通过检测TCP5的表达情况来指示拟南芥叶片锯齿状边缘的发生情况，由此提供一种拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因功能性分子标记及其应用。为达到以上技术目的，本申请采用的技术方案如下：一种拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因功能性分子标记，所述分子标记为SEQIDNo.1所示的序列。优选地，所述分子标记通过由SEQIDNo.2和SEQIDNo.3所示的序列组合成的引物克隆得到。一种重组表达载体，其包含如前所述的拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因功能性分子标记的序列。所述重组表达载体还包括具有指示性功能的报告基因。优选地，所述报告基因为显色基因。进一步优选地，所述显色基因为β-葡萄糖苷酸酶基因。如前所述的拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因功能性分子标记在验证植物植株发育状态中的应用。如前所述的拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因功能性分子标记在验证植物叶片发育状态中的应用。与现有技术相比较，本申请具有如下优势：(1)本申请的拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因功能性分子标记通过GUS染色技术即可快速验证植株或植株叶片的发育状态，操作简单易行，实验结果可靠。(2)本申请的拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因功能性分子标记验证了TCP5与拟南芥叶片锯齿状边缘的形状的相关性，有利于TCP转录因子功能的深入研究。附图说明图1为本申请拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因功能性分子标记及其应用中，TCP5p:GUS在拟南芥第6片莲座叶不同发育时期的信号分布情况。具体实施方式以下结合附图和具体实施方式对本申请作进一步详细描述。一、克隆TCP5基因的启动子以拟南芥野生型(标记为Col-0)的DNA为模板，以PrimeHSDNA聚合酶为DNA聚合酶，TCP5proF-KpnI(SEQIDNo.2)和TCP5Rev4-PstI(SEQIDNo.3)分别为上下游引物，进行PCR以扩增TCP5的启动子区域。将PCR产物和TSK108质粒均用Thermofisherscientific的限制性内切酶KpnI和PstI进行酶切，恒温37℃酶切30min，热失活80℃,5min，以获得TCP5的插入片段(即启动子片段，如SEQIDNo.1所示)。所述插入片段和载体按6：1的摩尔比在25℃连接3h。向解冻好的Trans-TI感受态细胞加入10μl连接好的质粒混合液，冰浴20min-30min。于42℃金属浴中90s进行热激，冰浴4-6min。往冰浴好的混合液加入600μlLB液体培养基，放置于37℃摇床上50min-60min进行活化。取出活化好的感受态细胞，倒于LB(Amp+)固体平板，干燥彻底后倒置过来于37℃恒温培养箱中培养12-16h。观察37℃烘箱里面的平板上长出的菌落克隆，选择特征为圆形边缘整齐、表面光滑、半透明、小凸起和菌落间互相分开的大肠杆菌单克隆进行菌落PCR。将鉴定出来的阳性菌落进行测序。在musclealignment网站上将测序结果对照TAIR网站上的基因序列信息进行对照分析，直至测序得到的碱基序列和TAIR上的基因序列完全匹配则说明该TCP5的启动子序列克隆成功。二、构建TCP5:GUS载体本实施例采用Gateway技术构建TCP5:GUS载体。所述TCP5:GUS载体属于人工合成的重组表达载体，具体为连接有目的片段(TCP5启动子，)的pMDC162质粒。本领域技术人员应当理解，根据实验的需要，目的基因/片段可以连接到不同的表达载体上形成包含有所述目的基因的重组真核表达载体，或者该重组真核表达载体能够编码目的基因所编码的氨基酸序列，其所产生的肽链或者蛋白质能在转染细胞内发挥作用。Gateway技术基于已研究得非常清楚的λ噬菌体位点特异重组系统(attBxattP→attLxattR)，其中BP和LR两个反应构成了Gateway技术。具体地，BP反应利用一个attBDNA片段或表达克隆一个和attP供体载体之间的重组反应，以创建一个入门克隆；LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。LR反应用来在平行的反应中转移目的序列到一个或多个目的载体上。将TCP5启动子区域通过BP反应克隆到Gateway技术中的TSK108载体后，再通过LR反应将TCP5启动子区域置于目的载体(pMDC162)中的GUS基因编码序列之前。GUS基因就是β-葡萄糖苷酸酶基因,该基因产物为β-葡萄糖苷酸酶，属水解酶类，相当稳定而不易降解。可使用市售的底物在原位显现出酶的活性，以肉眼即可检测其产物，非常方便。GUS基因存在于E.coli等一些细菌基因组内，编码β-葡萄糖苷酸酶。在Gateway系统表达全长开放阅读框β-葡萄糖苷酸酶是一个水解酶，以β-葡萄糖苷酸酯类物质为底物，其反应产物可用多种方法检测出来。由于绝大多数植物没有检测到葡萄糖苷酸酶的背景活性，因此这个基因被广泛应用于基因调控的研究中。本实施例使用了GUS基因作为报告基因，以检测拟南芥叶片的锯齿状边缘形状与TCP5的表达的关联性。三、TCP5:GUS侵染拟南芥将扩大培养好的已转化了目的质粒(TCP5:GUS)的农杆菌菌液，室温6000xg离心10min，弃上清液，农杆菌沉淀悬浮于5％蔗糖渗透培养液中，使OD600为0.8-1.0。在侵染植物之前再在菌液里面加入0.010％-0.015％SilwetL-77,摇匀。拟南芥的地上部分浸入农杆菌悬浮液中侵染40s。将侵染好的植株平放在铺有湿纸巾的黑色托盘里，遮光处理18-22h后，掀开盖子，将植株放置于人工培养室中光照培养，培养室条件为22℃恒温的连续光照。四、筛选转基因植株本实验采用抗生素培养基和PCR进行阳性种子的筛选。抗性基因构建于T-DNA中，转基因阳性植株可在对应的抗生素培养基中存活下来。将Tl代种子先用75％的酒精浸泡，放在摇床清洗15min。将消毒后的种子均匀地铺展在潮霉素抗性本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因功能性分子标记，其特征在于：所述分子标记为SEQ ID No.1所示的序列。/n
【技术特征摘要】
1.一种拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因功能性分子标记，其特征在于：所述分子标记为SEQIDNo.1所示的序列。
2.如权利要求1所述的拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因功能性分子标记，其特征在于，所述分子标记通过由SEQIDNo.2和SEQIDNo.3所示的序列组合成的引物克隆得到。
3.一种重组表达载体，其特征在于，其包含如权利要求1所述的拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因功能性分子标记的序列。
4.如权利要求3所述的重组表达载体，其特征...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄腾波，王可仪，
申请(专利权)人：深圳大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。