一种结直肠癌实体瘤组织样本保存液制造技术

本发明专利技术公开了一种结直肠癌实体瘤组织样本保存液。本发明专利技术样本保存液由胎牛血清、抗菌抗真菌剂三抗、HEPES和HBSS组成；其中，所述胎牛血清的终浓度为1‑5％(体积分数)；所述抗菌抗真菌剂三抗中的青霉素的终浓度为100‑200U/mL、链霉素的终浓度为100‑200μg/mL、两性霉素B的终浓度为250‑500ng/mL；所述HEPES的终浓度为8‑12mM；余量均为HBSS。利用本发明专利技术方法得到的结直肠癌原代细胞培养物可用于多种细胞水平的体外实验、二代测序、构建动物模型、构建细胞系等等。可以预见，这种培养方法和本发明专利技术所提供的样本保存液在结直肠癌的研究和临床诊断治疗领域具有广泛的应用前景。

A kind of solid tumor tissue sample preservation solution for colorectal cancer

【技术实现步骤摘要】
一种结直肠癌实体瘤组织样本保存液
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种结直肠癌实体瘤组织样本保存液。
技术介绍
结直肠癌是最常见的严重威胁人类的健康恶性肿瘤之一。在我国结直肠癌的发病率为9.24％，在所有恶性肿瘤中占第四位。而结直肠癌的死亡率为11.77％，在全部恶性肿瘤中占第五位。随着经济的发展、生活水平的提高和生活方式的改变，结直肠癌的发病率还将呈不断上升的趋势。另外，结直肠癌复发转移风险高，超过50％的结直肠癌患者会在根治性治疗后数月到数年内出现不同程度的复发转移。尽管世界各国的科研和医疗机构对结直肠癌的病因以及发生发展过程的研究都有很大力度的投入，但是人类对这种疾病仍然知之甚少。结直肠癌是一种复杂疾病，其发生、发展是一个动态的过程，涉及到诸多信号分子相互作用，形成了一个复杂的分子调控网络，同时还受到外界环境因素的影响。结直肠癌的病因和发生发展过程有很强的个体差异性，不能一概而论。因此将结直肠癌实体瘤原代细胞培养物作为模型进行个体化精准研究是结直肠癌研究领域乃至结直肠癌诊断治疗领域的趋势。术中所取的新鲜肿瘤组织样本由于不能即刻进行原代细胞的分离，因此好的样本保存液对于有样本离体后短时间内维持样本中细胞的活性至关重要，可以说这是影响原代肿瘤细胞分离与培养效果中的一个重要环节。
技术实现思路
为了有效解决上述技术问题，本专利技术提供了一种新的结直肠癌实体瘤原代细胞培养技术及配套试剂，本专利技术采用了一种新的样本保存液，其可在样本离体后短时间内维持样本中细胞的活性。第一方面，本专利技术要求保护一种结直肠癌实体瘤组织样本保存液。本专利技术所提供的结直肠癌实体瘤组织样本保存液由胎牛血清、抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)、HEPES和HBSS(Hank's平衡盐溶液)组成。其中，所述胎牛血清在所述样本保存液中的终浓度为1-5％(如2％，％表示体积百分含量)；所述抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)中的青霉素在所述样本保存液中的终浓度为100-200U/mL(如100U/mL)；所述抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)中的链霉素在所述样本保存液中的终浓度为100-200μg/mL(如100μg/mL)；所述抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)中的两性霉素B在所述样本保存液中的终浓度为250-500ng/mL(如250ng/mL)；所述HEPES在所述样本保存液中的终浓度为8-12mM(如10mM)；余量均为HBSS。进一步地，所述抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)组成如下：每毫升包含10000单位青霉素(碱)、10000μg链霉素(碱)和25μg两性霉素B。所述抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)为“Antibiotic-Antimycotic,100X”(如Gibco#15240062，或与其组成相同的其他产品)。所述“Antibiotic-Antimycotic,100X”每毫升包含10000单位青霉素(碱)、10000μg链霉素(碱)和25μg两性霉素B，利用0.85％盐液形式的青霉素G(钠盐)、硫酸链霉素和两性霉素B作为抗真菌剂。在本专利技术的具体实施例中，所述胎牛血清的品牌货号为Gibco#16000-044；所述抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)的品牌货号为Gibco#15240062；所述HEPES的品牌货号为Gibco#15630080；所述HBSS的品牌货号为Gibco#14170161。所述样本保存液存在形式可为两种：其一，所述样本保存液为由所述胎牛血清、所述抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)、所述HEPES和所述HBSS(Hank's平衡盐溶液)混合而成的溶液。所述样本保存液配制好后4℃可保存1个月。其二，所述样本保存液中的各组分单独存在，使用时按照配方进行配制。第二方面，本专利技术要求保护所述样本保存液在保存结直肠癌实体瘤组织中的应用。第三方面，本专利技术要求保护一种保存结直肠癌实体瘤组织的方法。本专利技术所体用的保存结直肠癌实体瘤组织的方法，具体可包括如下步骤：将刚刚离体的结直肠癌实体瘤组织(如手术过程中从患者体内刚取出的新鲜结直肠癌实体瘤组织)置于前文所述的样本保存液中保存，保存时间为2小时以内。第四方面，本专利技术要求保护一种从结直肠癌实体瘤组织中解离出结直肠癌实体瘤原代细胞的方法。本专利技术所提供的从结直肠癌实体瘤组织中解离出结直肠癌实体瘤原代细胞的方法，具体可包括如下步骤：(1)将刚刚离体的结直肠癌实体瘤组织置于前文所述的样本保存液中保存，2小时以内按照如下步骤对所述结直肠癌实体瘤组织进行解离前处理：用体积百分含量为70-75％(如75％)的乙醇清洗结直肠癌实体瘤组织样本表面10到30秒；用样本清洗液清洗所述结直肠癌实体瘤组织样本10-20次(如10次)，用无菌的PBS溶液清洗所述结直肠癌实体瘤组织样本5-10次(如5次)；然后除去所述结直肠癌实体瘤组织样本中的杂质、结缔组织、脂肪组织、坏死组织等影响原代细胞培养的成分。(2)用样本解离液对步骤(1)处理后的所述结直肠癌实体瘤组织进行解离处理，获得结直肠癌实体瘤原代细胞。其中，所述样本解离液由胶原酶I、胶原酶II、胶原酶IV和PBS组成；其中，所述胶原酶I在所述样本解离液中的终浓度为150-250U/mL(如200U/mL)；所述胶原酶II在所述样本解离液中的终浓度为150-250U/mL(如200U/mL)；所述胶原酶IV在所述样本解离液中的终浓度为50-150U/mL(如100U/mL)；余量均为PBS。其中，用蛋白酶的酶活来定义胶原酶(所述胶原酶I、所述胶原酶II或所述胶原酶IV)的单位U：在37℃，pH7.5的条件下，用1U蛋白酶处理胶原酶(所述胶原酶I、所述胶原酶II或所述胶原酶IV)5小时，可以释放L-亮氨酸1μmol。在本专利技术的具体实施例中，所述胶原酶I的品牌货号为Gibco#17100-017；所述胶原酶II的品牌货号为Gibco#17101-015；所述胶原酶IV的品牌货号为Gibco#17104-019；所述PBS的品牌货号为Gibco#21-040-CVR。其中的胶原酶I、胶原酶II和胶原酶IV可以储液(母液)形式-20℃长期保存，具体可为10倍储液(母液)。10×胶原酶I储液由所述胶原酶I和PBS组成；其中所述胶原酶I的终浓度为2000U/mL；10×胶原酶II储液由所述胶原酶II和PBS组成；其中所述胶原酶II的终浓度为2000U/mL；余量均为PBS；10×胶原酶IV储液由所述胶原酶IV和PBS组成；其中所述胶原酶IV的终浓度为2000U/mL；余量均为PBS。所述胶原酶I、胶原酶II和所述胶原酶IV的酶活定义见前文。进一步地，所述样本清洗液由抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)和PBS组成；其中，所述抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)中的青霉素在所述样本清洗液中的终浓度为1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种结直肠癌实体瘤组织样本保存液，其特征在于：所述样本保存液由胎牛血清、抗菌抗真菌剂三抗、HEPES和HBSS组成；其中，所述胎牛血清在所述样本保存液中的终浓度为1-5％(体积百分含量)；所述抗菌抗真菌剂三抗中的青霉素在所述样本保存液中的终浓度为100-200U/mL；所述抗菌抗真菌剂三抗中的链霉素在所述样本保存液中的终浓度为100-200μg/mL；所述抗菌抗真菌剂三抗中的两性霉素B在所述样本保存液中的终浓度为250-500ng/mL；所述HEPES在所述样本保存液中的终浓度为8-12mM；余量均为HBSS。/n

【技术特征摘要】
1.一种结直肠癌实体瘤组织样本保存液，其特征在于：所述样本保存液由胎牛血清、抗菌抗真菌剂三抗、HEPES和HBSS组成；其中，所述胎牛血清在所述样本保存液中的终浓度为1-5％(体积百分含量)；所述抗菌抗真菌剂三抗中的青霉素在所述样本保存液中的终浓度为100-200U/mL；所述抗菌抗真菌剂三抗中的链霉素在所述样本保存液中的终浓度为100-200μg/mL；所述抗菌抗真菌剂三抗中的两性霉素B在所述样本保存液中的终浓度为250-500ng/mL；所述HEPES在所述样本保存液中的终浓度为8-12mM；余量均为HBSS。


2.权利要求1所述的样本保存液在保存结直肠癌实体瘤组织中的应用。


3.一种保存结直肠癌实体瘤组织的方法，包括如下步骤：将刚刚离体的结直肠癌实体瘤组织置于权利要求1所述的样本保存液中保存，保存时间为2小时以内。


4.一种从结直肠癌实体瘤组织中解离出结直肠癌实体瘤原代细胞的方法，包括如下步骤：
(1)将刚刚离体的结直肠癌实体瘤组织置于权利要求1所述的样本保存液中保存，2小时以内按照如下步骤对所述结直肠癌实体瘤组织进行解离前处理：用体积百分含量为70-75％的乙醇清洗结直肠癌实体瘤组织表面；用样本清洗液和无菌的PBS溶液先后清洗所述结直肠癌实体瘤组织；
(2)用样本解离液对步骤(1)处理后的所述结直肠癌实体瘤组织进行解离处理，获得结直肠癌实体瘤原代细胞；
所述样本解离液由胶原酶I、胶原酶II、胶原酶IV和PBS组成；其中，所述胶原酶I在所述样本解离液中的终浓度为150-250U/mL；所述胶原酶II在所述样本解离液中的终浓度为150-250U/mL；所述胶原酶IV在所述样本解离液中的终浓度为50-150U/mL；余量均为PBS。


5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述样本清洗液由抗菌抗真菌剂三抗和PBS组成；其中，所述抗菌抗真菌剂三抗中的青霉素在所述样本清洗液中的终浓度为100-200U/mL；所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：张函槊，尹申意，
申请(专利权)人：北京吉尚立德生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11