本发明专利技术提供一种流式电转染装置，包括管体，第一电极对，第二电极对，其特征在于，所述第一电极对和第二电极对相邻设置于管体的侧壁，所述管体与第一电极对形成腔体，所述管体与第二电极对形成腔体，所述第一电极对施加高压短脉宽电信号，所述第二电极对施加低压长脉宽或持续电信号。该流式电转染装置可以对大体积样品在持续稳定流动过程中进行电转染，在保证细胞存活率的前提下，显著提高细胞电转染效率和蛋白表达量。
A flow cytometric transfection device combining high and low voltage modes
The invention provides a flow type electric transfection device, which comprises a tube body, a first electrode pair and a second electrode pair. The first electrode pair and the second electrode pair are adjacent to each other on the side wall of the tube body, the tube body and the first electrode pair form a cavity, the tube body and the second electrode pair form a cavity, the first electrode pair applies a high-voltage short pulse width electric signal, and the second electrode pair forms a cavity Apply low voltage long pulse width or continuous electrical signal. The flow cytometry can be used to transfect large volume of samples in the process of continuous and stable flow. On the premise of ensuring cell survival rate, it can significantly improve the efficiency of cell transfection and protein expression.
【技术实现步骤摘要】
一种结合高压和低压模式的流式电转染装置
本专利技术涉及电转染的方法，特别是涉及一种流式电转染装置，具体是涉及一种结合高压和低压模式的流式电转染装置。
技术介绍
细胞膜是包围在细胞外周的一层薄膜，厚度约为7～10nm，细胞膜的化学组成基本相同，主要由脂类、蛋白质和糖类组成。各成分含量分别约为50％、40％、2％～10％。其中，脂质的主要成分为磷脂和胆固醇。此外，细胞膜中还含有少量水分、无机盐与金属离子等。磷脂双分子层是构成细胞膜的基本支架，是细胞与外界进行选择性物质交换的通透性屏障。细胞膜使细胞成为一个独立的生命单位，并拥有一个相对稳定的内环境。细胞可以通过细胞膜从周围环境摄取养料，排出代谢产物，使物质的转运达到平衡状态。所以，细胞膜的基本功能就是维持细胞内微环境的相对稳定并有选择地与外界环境进行物质交换。周围环境中的一些小分子物质可以通过被动运输通过细胞膜，但其它大分子物质则不能自主通过细胞膜。70年代，科学家首次发现“电穿孔”术，其电场被用于在细胞膜上形成孔，而不会引起细胞永久损伤。研究发现，如果对细胞施加一定强度的电刺激并持续一段时间，就可以诱导细胞膜上产生一些微孔，使细胞的通透性增强，所谓细胞电穿孔(Electroporation)就是指细胞在外加脉冲电场的作用下，细胞膜脂双层上形成瞬时微孔的生物物理过程。电转染(Electrotransfection)是利用电穿孔技术将外源的生物大分子，如DNA、RNA或蛋白质导入细胞的技术。电转染术已应用于试管内和体内程序，如ECM600、Bio-Rad等产品。已知的试管内及体内应用的电转染，可将瞬时高压脉冲施加于位于实施区域周围的电极上。电极之间产生的电场会使细胞膜瞬时变成多孔的，外源分子通过自由扩散或者电流的作用进入该细胞。在已知的电转染应用中，这类电场包括1000V/cm的单个方波，脉宽大约100-100000μs。在电转染过程中，不受控制的电场和电击过程中产生的气泡，会通过改变电流在细胞壁形成永久的孔，会对细胞产生一定的损伤。而抗体生产中，工程细胞在电转染完7-21天进行蛋白质表达，对细胞活力的要求也相对较高。因此，在电转过程中提供合适的开孔电压和扩散电流，在获得高转染效率的同时，保证细胞存活率至关重要。当细胞膜发生电穿孔时，其细胞膜表面发生跨膜电位变化，导致磷脂双分子层重排，从而导致细胞膜的通透性瞬时增大，使亲水分子、DNA、蛋白质、病毒颗粒、药物颗粒等正常情况下不能通过细胞膜的分子得以进入细胞。在短时间内撤除电刺激后，细胞膜可以自我恢复，重新成为选择性通透屏障。与传统的化学转染和病毒转染相比，由于电转染具有无化学污染、不会对细胞造成永久性损伤、效率较高等优点，在生物物理学、分子生物学、临床医学等领域有着广阔的应用前景。虽然电转染作用的机理并不完全清楚，但在本文中细胞电转染是公知的，包括细胞膜脂双层的破裂，导致在膜上形成暂时性的微孔，允许外源性分子通过扩散进入细胞。现有技术中，主要有三类方法来完成细胞电转染的过程：将细胞放置于一对相距数毫米至数厘米的平行电极之间。使细胞在电极之间的电场中受到电刺激，以实现电转染的目的。例如，专利US5389069。使用微型针状电极扎入组织或细胞液中对细胞进行电击，达到电转染的目的。例如，专利号CN101020892A。将一个腔室放置在一对平行电极之间，使得细胞的悬浮溶液在腔室中流动的同时受到电击。例如，专利号CN1195997A。在现有技术中公开的电转染设备及方法大部分不适用于处理大量的样品，也不适用于连续处理样品。也就是说，现有技术中得到的电转染室均是“静态”工作的，即：在电转染室处理完一批样品以后，需要对电转染室进行清洗、重新加入细胞等处理，才能继续下一批样品处理。在公开的技术中，电转染常常是在一次性单室试管中进行的，其用于电转染的最大容量通常小于1ml。在需要处理大量样品的场合中，这种技术冗长乏味，劳动强度大。中国专利CN99812447公开了一种电打孔方法和电打孔仪器，可根据用户指定的脉冲和温度模式，产生和施加电场。该仪器包括带有构成电极结构一部分的帕耳帖(Peltier)装置的试管固定器，所述电极结构也是固定器的一部分。脉冲包括第一持续时间的低压脉冲，紧接着是第二持续时间高压脉冲，其后立即是第三持续时间的低压脉冲。低压电打孔的电场将分子积聚在细胞表面，适当的高压电场使细胞开孔，并且最终的低压电场将分子移送进细胞。分子可以是DNA、DNA片段、化学制剂等；接收细胞可以是卵细胞、血小板、人体细胞、红细胞、哺乳动物细胞、植物的原生质体、植物花粉、脂质体、细菌、真菌、酵母、精子和其他合适的细胞。分子置于细胞的附近，或在细胞周围组织的间隙中、或含有细胞的液体介质中。如果电压不够高或脉宽不够长，不能在细胞膜上形成有效大小或时长的小孔，外源分子就无法进入细胞；如果能量过于集中，会造成细胞膜永久性破坏，导致大量细胞的死亡。因此，紧接着高压脉冲放电之后，长时间的低电压脉冲对提高细胞的电转染效率、表达量及细胞活力是必要的。中国专利CN201310086625公开了原代淋巴细胞进行电转染的方法，其特征包括：对原代淋巴细胞进行四次放电，放电之间进行两次暂停：第一次放电：电压为500～1500V的正向脉冲，持续时间20～60μs；第一次暂停：暂停持续时间600～1200μs；第二次放电：电压为500～1500V的负向脉冲，持续时间20～60μs；第二次暂停：暂停持续时间600～1200μs；第三次放电：电压为500～1500V的正向脉冲，持续时间10～50μs；第四次放电：电压为100～300V的正向电泳电场，持续时间20～100ms。能够大幅度提高电转染的成功率，在外周血单核细胞转染绿色荧光蛋白细胞学实验结果中转染效率达到了50％左右，为开发肿瘤的生物治疗药物提供了关键技术支持。虽然CN201310086625公开了通过正负方向高压脉冲电场和低压脉冲电场组合的方法，能够对细胞膜进行两个方向的电转染，提高电转染细胞总数和膜转染的数量，由此提高了电转染效率。但是该装置只能局限于单个电转杯，小体积电转染，不能满足进行肿瘤免疫治疗1010细胞总量的需求。况且即使将单个电转杯制成流式的电转杯，即便能够实现同一电极在极短的时间进行高压和低压的转换，由于细胞是在电转杯中流动的状态，细胞经过电极时不能同时接受高压和低压电场的作用，对于电转染效率和细胞的存活率难以做到与静态单个电转杯同样的电转染效果。
技术实现思路
本专利技术是针对上述现有的技术存在的技术问题，提供了一种通过两组电极对相邻的形式，分别实施高压短脉宽和低压长脉宽，对流动的细胞进行电转染，在保证细胞存活率的前提下，显著提高细胞电转染效率和蛋白表达量，并能处理大体积样品的流式电转染装置。为了达到上述目的，本专利技术所提供结合高压和低压的流式电转染装置的技术方案概述如下：一种流式电转染装置，包括管体，第一电极对，第二电极对，其特征在于，所述第一电极对和第二电极对相邻设置于管体的侧壁，所述管体与第一电极对形成腔本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种流式电转染装置，包括管体，第一电极对，第二电极对，其特征在于，所述第一电极对和第二电极对相邻设置于管体的侧壁，所述管体与第一电极对形成腔体，所述管体与第二电极对形成腔体，所述第一电极对施加高压短脉宽电信号，所述第二电极对施加低压长脉宽电信号。/n
【技术特征摘要】
1.一种流式电转染装置，包括管体，第一电极对，第二电极对，其特征在于，所述第一电极对和第二电极对相邻设置于管体的侧壁，所述管体与第一电极对形成腔体，所述管体与第二电极对形成腔体，所述第一电极对施加高压短脉宽电信号，所述第二电极对施加低压长脉宽电信号。
2.根据权利要求1所述的流式电转染装置，其特征在于，所述第一电极对包括第一电极和第二电极，且第一电极和第二电极平行设置。
3.根据权利要求1所述的流式电转染装置，其特征在于，所述第二电极对包括第三电极和第四电极，且第三电极和第四电极平行设置。
4.根据权利要求1所述的流式电转染装置，其特征在于，所述第一电极对之间的距离小于等于所述第二电极对之间的距离。
【专利技术属性】
技术研发人员：汪莹，黄强，朱士英，
申请(专利权)人：苏州壹达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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