一种雾化噬菌体杀菌效果的评价方法技术

本申请属于医疗卫生防治技术领域，具体涉及一种雾化噬菌体杀菌效果的评价方法。该方法包括：设置样品点、噬菌体制备、噬菌体雾化喷施等步骤。总体而言，现有噬菌体灭菌研究中，由于主要局限于实验性探索研究，而就实际应用而言，则需详细考虑噬菌体应用方式、应用量以及应用效果之间的平衡，才能为噬菌体在耐药细菌防治中的应用奠定良好技术基础。本申请中，通过噬菌体喷施方式的质控和喷施效果的评价，初步建立了一种较为全面的噬菌体应用效果评价方法，可为噬菌体在耐药细菌防控中的实际推广应用奠定一定技术评价基础。

A method to evaluate the germicidal efficacy of aerosol phage

The application belongs to the technical field of medical and health control, in particular to a method for evaluating the germicidal efficacy of atomized bacteriophages. The method comprises the following steps: setting sample points, preparation of bacteriophage, and atomization spraying of bacteriophage. Generally speaking, the existing research on phage sterilization is mainly limited to experimental exploration and research, but in terms of practical application, it is necessary to consider the balance between phage application mode, application amount and application effect in detail, so as to lay a good technical foundation for the application of phage in the prevention and control of drug-resistant bacteria. In this application, through the quality control of phage spraying method and the evaluation of spraying effect, a relatively comprehensive evaluation method of phage application effect is preliminarily established, which can lay a certain technical evaluation foundation for the practical application of phage in the prevention and control of drug-resistant bacteria.

【技术实现步骤摘要】
一种雾化噬菌体杀菌效果的评价方法
本申请属于医疗卫生防治
，具体涉及一种雾化噬菌体杀菌效果的评价方法。
技术介绍
近年来，超级细菌（耐药细菌）的出现日益引起人们的重视。2017年2月27日，世界卫生组织基于临床中的耐药情况、耐药导致的死亡率、人们因此发生感染的频率和这些感染给医疗保健体系带来的负担，首次发布了12种被列为最高优先级的超级细菌名单，并根据危险程度将它们分为紧急、高等优先级和中等优先级三类。其中对碳青霉烯类抗生素耐药的鲍氏不动杆菌、绿脓杆菌和肠杆菌科细菌的危险程度最高，被列入紧急等级，这些高致病菌不仅会引发耐药感染，如肺炎、伤口或血液感染，甚至致命，给现有的医疗体系带来沉重负担。多项调查研究显示，在医院环境中这些紧急等级的超级细菌检出率非常高。它们可通过直接接触、间接接触、飞沫和空气、甚至通过蚊子苍蝇等悄然在医院环境以及在人和人之间中快速传播，这对医院高危科室的危重病人将是致命的。而现有常规使用的对环境和物品消毒的物理和化学方法，因为具有刺激性、毒性和腐蚀性，所以在人员密集、带菌人群持续存在的医院环境，其作用范围因此受到限制，不可能达到彻底清洁消毒，阻断超级细菌传播的作用效果，这是超级细菌流行传播造成医院内感染持续存在的根本原因。人们需要新型制剂来科学有效防控医院内超级细菌感染。噬菌体是一类感染细菌的病毒，是自然界普遍存在的细菌天敌。它们具有很强的宿主特异性强，杀菌精准，不破坏微生态，同时更不会感染人类或动植物，因此，精准杀灭环境中目标超级细菌的噬菌体将是未来一种纯天然、无色无刺激、无毒无害、无残留、绿色高效的新型杀菌产品。因此，噬菌体的应用对于控制医疗环境中超级细菌的扩散以及确保医疗效果具有十分重要的技术价值。但另一方面，现有技术中广谱性消毒杀菌效果的评价方法并不适用于窄谱抗菌型噬菌体灭菌效果评价，其主要原因和区别在于：广谱型杀菌效果评价方法主要是通过计算消毒前后总的微生物数量差异（主要包括细菌和真菌等）即可计算；而噬菌体由于灭菌对象较为专一，对于既有灭菌对象（宿主菌）又有非灭菌对象存在情况下，很难通过数量上的区别来进行直接评价。而常规评价方法中，对于噬菌体作用效果评价，一般又主要是基于特定宿主菌的噬菌斑直径、菌斑数量、透明度等形态指标进行评价，并不适用于实际环境中噬菌体灭菌效果评价。因此，设计一种较为科学和客观的、适于实际应用的噬菌体灭菌效果评价方法，对于推广噬菌体灭菌应用、耐药细菌控制都具有十分重要的技术价值。
技术实现思路
本申请目的在于提供一种雾化噬菌体杀菌效果的评价方法，从而为相关噬菌体在实际医疗环境灭菌中应用以及超级细菌防治等方面奠定一定技术基础。本申请所采取的技术方案详述如下。一种雾化噬菌体杀菌效果的评价方法，包括如下步骤：（1）样品点设置在待评价环境中选择评价用样品点，然后在对应样品点布设质控用质控样和评价用评价样，优选还设有对照样；所述质控样为：含10ml无菌生理盐水（或SM培养液、或其他无菌培养液）的平皿；所述评价样为：含有噬菌体作用目标的目标菌（宿主菌）的平皿；所述对照样：为监测现有环境中微生物存量情况的含有无菌LB或NB或其他适合培养目标超级细菌的培养基的平皿；（2）噬菌体制备将噬菌体与宿主菌按照最佳感染复数（MOI）加入LB培养基中，在37℃、120rpm震荡条件下增殖至菌液由浑浊变澄清，最终制备高纯度且高效价噬菌体液体，最终噬菌体液体中噬菌体浓度应达到1011PFU/ml以上；具体制备高纯度且高效价噬菌体液体时，可参考《分子克隆》（J.萨姆布鲁克,D.W.拉塞尔，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社,2002）中λ噬菌体大规模培养、浓缩和纯化的方法进行制备；（3）噬菌体雾化喷施将步骤（2）中所制备噬菌体均匀雾化喷施于步骤（1）中的待评价环境中；通过质控样来监测和评价噬菌体的喷出效果和喷出后分布效果；通过评价样来监测噬菌体对目标菌的直接杀灭作用；具体雾化喷施前，可利用生理盐水对步骤（2）中所制备噬菌体进行适当稀释，以便于后续雾化喷施，但稀释后液体中噬菌体终浓度应不低于109PFU/ml，以确保后续灭菌作用效果；具体雾化喷施时，应采用家用或工业级的、带有可左右或四周摇头风扇的、且雾化颗粒为纳米级大小（＜1μm）的雾化器进行噬菌体雾化喷施，以确保喷施均匀；雾化喷施过程中，雾化的房间需要关闭门窗，以确保评价结果的准确性；雾化喷施过程中，对房间雾化的总时间可根据噬菌体液体的实际效价、所用雾化器对液体的雾化效率、房间面积进行估算；雾化达到完全杀菌时，噬菌体的浓度越高、和/或雾化器的效率越高，所需要的雾化时间就越短，反之，就越长；实际操作时，参考本专利技术所提供的方法，可先通过实施具体的雾化实验，测得使监测位点杀菌平皿中人为接种的目标菌被完全杀灭时，相应监测位点质控平皿所收集到的噬菌体最小量，再根据此最小量，结合房间实际面积，得出完全杀菌所需最小噬菌体施用量的估算值（PFU/cm2），以估算值作为实际施用量的参考；噬菌体雾化的总时间可参考如下计算公式进行估算：雾化时间（min）=[噬菌体施用量估算值（PFU/cm2）×房间面积（cm2）]÷[雾化效率（ml/min）×噬菌体效价（PFU/ml）]噬菌体的实际施用量可参考如下计算公式进行计算：噬菌体施用量（PFU/cm2）=雾化时间（min）×雾化效率（ml/min）×噬菌体效价（PFU/ml）÷房间面积（cm2）；针对噬菌体的施用量的计算结果，应该确保喷雾结束后每平方厘米噬菌体的施用量超过完全杀菌最小噬菌体施用量（即，对监测点人为放置的带菌样中目标指示菌的杀菌率达到100%）。需要进一步解释的是，由于噬菌体是一种可以自我增殖的生物杀菌剂，即杀菌的过程会伴有噬菌体指数级的增多，因此，实际应用噬菌体所需要的量并非绝对值。上述技术方案中所计算获得的数值是在不考虑噬菌体增殖的情况下（高感染复数杀菌）估算的噬菌体杀菌的最小施用量，由于噬菌体颗粒只有几十纳米大小，因此极易随雾化过程而均匀分布，就像在房间内布下了噬菌体“颗粒弹”形成的天罗地网，此施用量可保证噬菌体在增殖或不增殖的所有情况下，都能达到能彻底杀灭相应监测点人为接种的超级细菌，因此，理论上这样浓度布阵的噬菌体“颗粒弹”也同样能杀灭环境中播散流行的同种噬菌体分型的超级细菌。总体而言，现有噬菌体灭菌研究中，由于主要局限于实验性探索研究，而就实际应用而言，则需详细考虑噬菌体应用方式、应用量以及应用效果之间的平衡，才能为噬菌体在耐药细菌防治中的应用奠定良好技术基础。本申请中，通过噬菌体喷施方式的质控和喷施效果的评价，初步建立了一种较为全面的噬菌体应用效果评价方法，可为噬菌体在耐药细菌防控中的实际推广应用奠定一定技术评价基础。附图说明图1为噬菌体雾化1min时各采样点质控样平皿中监测的噬菌体收集量；图2为噬菌体雾化1min时各采样点评价平皿中目标菌的杀本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种雾化噬菌体杀菌效果的评价方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：/n一种雾化噬菌体杀菌效果的评价方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：/n（1）样品点设置/n在待评价环境中选择、设计评价用样品点，然后在对应样品点布设质控用质控样和评价用评价样；/n所述质控样为：含无菌生理盐水或SM培养液的平皿；/n所述评价样为：含有噬菌体作用目标的目标菌的平皿；/n（2）噬菌体制备/n将噬菌体与宿主菌按照最佳感染复数加入培养基中，增殖至噬菌体浓度达到10

【技术特征摘要】
1.一种雾化噬菌体杀菌效果的评价方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
一种雾化噬菌体杀菌效果的评价方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
（1）样品点设置
在待评价环境中选择、设计评价用样品点，然后在对应样品点布设质控用质控样和评价用评价样；
所述质控样为：含无菌生理盐水或SM培养液的平皿；
所述评价样为：含有噬菌体作用目标的目标菌的平皿；
（2）噬菌体制备
将噬菌体与宿主菌按照最佳感染复数加入培养基中，增殖至噬菌体浓度达到1011PFU/ml以上；
（3）噬菌体雾化喷施
将步骤（2）中所制备噬菌体均匀雾化喷施于步骤（1）中的待评价环境中；
通过质控样来监测和评价噬菌体的喷出效果和喷出后分布效果；
通过评价...

【专利技术属性】
技术研发人员：靳静，王山梅，张兰，陈欣欣，徐鹏程，史学鹏，王小亭，张向前，
申请(专利权)人：希拓生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41