一种戊型肝炎ORF2蛋白制造技术

本发明专利技术提供一种戊型肝炎病毒ORF2蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2。本发明专利技术的Hexon蛋白可用于制备疫苗或诊断试剂。本发明专利技术的ORF2蛋白制备的戊型肝炎亚单位疫苗具有抗原稳定性高，纯度高，特异性强，不产生其他不相关抗体，检测方法方便准确的特点，为工业化生产戊型肝炎亚单位疫苗奠定了坚实的基础。

ORF2 protein of hepatitis E

The invention provides an ORF2 protein of hepatitis E virus, the amino acid sequence of which is SEQ ID No: 2. The hexon protein of the invention can be used for preparing vaccines or diagnostic reagents. The hepatitis E subunit vaccine prepared by ORF2 protein of the invention has the characteristics of high antigen stability, high purity, strong specificity, no other unrelated antibodies, convenient and accurate detection method, and lays a solid foundation for industrialized production of hepatitis E subunit vaccine.

【技术实现步骤摘要】
一种戊型肝炎ORF2蛋白
本专利技术属于疫苗蛋白筛选
，具体涉及一种戊型肝炎ORF2蛋白。
技术介绍
戊型肝炎是由戊型肝炎病毒(HepatitisEVirus，HEV)引起的以肠道传播为主的传染性疾病，具有急性病毒性肝炎的临床和流行病学特征,是一种经肠道传播的严重危害人类健康的病毒性肝炎。目前戊型肝炎在我国以及许多发展中国家中流行，在少数发达国家呈散发性流行。HEV是一种人畜共患病毒，已有报道显示HEV在自然条件下能感染鸡、鹿和兔等多种动物。戊型肝炎在一些爆发性发病鸡群中会使产蛋率下降20％以上。产蛋肉种鸡和30～72周龄产蛋母鸡HS综合征死亡率比正常死亡率高，40～50周龄发病率最高。病鸡可能出现鸡冠、肉垂苍白、沉郁、食欲不振、肛门口羽毛污染或有糊状粪便。现有的戊型肝炎疫苗为传统疫苗，是使用完整的病原体作为制苗用抗原。传统的灭活疫苗具有独特的优势如免疫后抗体均一，抗体效价高，但也存在制造疫苗使用的毒株培养困难，与临床流行毒株的抗原性存在较大差异，从而影响了攻毒保护效果的缺点，从而制约了灭活疫苗的应用。而且，使用全病毒抗原制备的传统疫苗免疫后产生的抗体，在临床上无法区分野毒感染或是疫苗免疫产生，会导致干扰疫情的监测。为解决传统疫苗的问题，就需要筛选新的毒株或者开发新的亚单位疫苗以克服现有疫苗的问题；因此筛选获得适用于制备亚单位疫苗的抗原蛋白就尤为关键。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种戊型肝炎ORF2蛋白，从而弥补现有技术的不足。本专利技术首先提供一种戊型肝炎病毒ORF2蛋白，包含有：1)氨基酸序列为SEQIDNO:2的蛋白；2)在1)的蛋白上取代、缺失、添加一个或几个氨基酸，且具有1)中蛋白功能的蛋白；编码上述戊型肝炎蛋白的基因，其核苷酸序列为SEQIDNO:1，对上述的ORF2蛋白进行优化，优化后的ORF2蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO:4；编码基因的序列为SEQIDNO:3；本专利技术的戊型肝炎ORF2蛋白可用于制备疫苗或诊断试剂。本专利技术的戊型肝炎ORF2蛋白制备的亚单位疫苗具有抗原稳定性高，纯度高，特异性强，不产生其他不相关抗体，检测方法方便准确的特点，为工业化生产戊型肝炎疫苗和诊断试剂奠定了坚实的基础。具体实施方式本专利技术从全国各地临床发生戊型肝炎的养殖场分离HEV，并对其临床流行病学和遗传变异进行分析，筛选到一株免疫原性好的戊型肝炎病毒(QD07株)，从中获得了一种新型的戊型肝炎病毒抗原蛋白(ORF2蛋白)，将其在大肠杆菌中获得进行可溶性的表达，制备亚单位疫苗。下面结合具体实施例对本专利技术进行详细的说明。实施例1：ORF2基因的扩增及序列分析2018年自大连地区的部分肉种鸡发生疑似戊型肝炎，经临床调查和实验室检测，初步诊断为戊型肝炎。经调查上述的发病鸡群之前已经注射过戊型肝炎疫苗，也做过中和抗体的检测。怀疑有戊型肝炎病毒在疫苗的选择压力下发生了突变，从发病鸡病料样品中分离出戊型肝炎病毒QD07株，作为扩增的模板。1、扩增戊型肝炎病毒ORF2基因根据NCBI中发表的戊型肝炎病毒ORF2基因序列，设计并合成了引物,引物的序列信息如下：primer1：5′-ATGTCGGTGCGTGGATTGTTGCTC-3′；primer2：5′-CTAGGGTGGTGAGGGAAACGT-3′。提取分离的病毒的核酸作为模板，用引物primer1和primer2进行PCR扩增目的片段，经序列测定核苷酸序列为SEQIDNO:1，编码蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO:2。与NCBI中已公布的戊型肝炎病毒ORF2基因进行核苷酸序列比对分析，结果核苷酸同源性约为83.4％～91.7％；推导的氨基酸第39位(Q变H)、198位(Y变F)、240位(G变P)、294位(T变A)、306位(D变E)、317位(L变I)、398位(S变T)、442位(A变D)、468位(T变N)、506位(F变I)发生变异，氨基酸序列同源性分析约为78.6％～97.1％。结果表明，分离的病毒为新的戊型肝炎病毒，含有新的ORF2基因。2、优化并合成戊型肝炎病毒ORF2基因分析所获得的戊型肝炎病毒ORF2基因的抗原特性，将ORF2基因的结构域进行剪切，将N端330aa剪切掉，把C端5aa剪切掉，并将N端加入3个脯氨酸3个精氨酸，帮助蛋白进行空间折叠和进行可溶性表达，同时将C(剪切修饰后的第61位、255位、256位)突变为R来帮助蛋白进行可溶性表达，表达出具有正确空间结构的蛋白，将其抗原位点更好地暴露出来。优化修饰后的氨基酸的序列为SEQIDNO:4，能很好地表达出抗原位点。通过以上的优化突变达到蛋白在大肠杆菌内的可溶性表达。设计合成用于ORF2蛋白表达的核苷酸序列为SEQIDNO:3，送上海生物工程有限公司公司合成后为模板，用引物primer3和primer4进行PCR扩增，目的片段产物回收连接pMD18-T载体，转化和筛选阳性克隆pMD18-T-ORF2。引物primer3和primer4的序列信息如下：primer3：5′-TTGAATTCCCCCCGCCGAGAAGAAGGA-3′；primer4:5′-AAGCGGCCGCCTACGTCCTACTAAGCCG-3′。实施例2：戊型肝炎病毒ORF2蛋白的重组表达1.ORF2蛋白的制备方法包括以下步骤：a.构建表达载体；b.构建表达菌株；c.重组ORF2蛋白的诱导和提取纯化。a.构建表达载体：将阳性克隆质粒pMD18-T-ORF2和表达载体pET28a载体分别用EcoRI和NotI双酶切产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳后,用DNA凝胶回收试剂盒回收,分别获得约5400bp和850bp片段,在16℃定向连接构建pET28a表达载体；测序验证序列和读码框无误后,将质粒线性化后，转化入BL21感受态细胞。b.构建表达菌株、蛋白提取纯化：转化后，37℃培养18h。挑取单菌落于LB液体培养基(含卡那霉素)中，37℃摇床振荡培养16小时后，10000r/min离心5min，收集菌体后，用沸水浴煮5min，12000r/min离心2min离心取上清作为模板，进行PCR鉴定,PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃1min，55℃1min，72℃1min，共进行32个循环；72℃10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，可以扩增出约850bp条带。检测结果表明，含ORF2基因的重组质粒成功转入BL21感受态细胞。将PCR检测阳性的菌株分别接种30mLLB培养基中，37℃摇床培养至OD600＝0.6,加入IPTG至终浓度1mmol/L，诱导6h,培养物离心后用1/20体积的PBS重悬，破碎后，离心取上清进行SDS-PAGE检测。同时，将没有改造前的基因(即含SEQIDNO:1基因)转入pET28a表达载体，作为未改造对照菌株进行了表达，破碎后取沉淀进行SDS-PAGE本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种戊型肝炎病毒ORF2蛋白，其特征在于，所述的ORF2蛋白包含有：/n1)核苷酸序列为SEQ ID NO:1的基因编码的蛋白；/n2)在1)的蛋白上取代、缺失、添加一个或几个氨基酸，且具有1)中蛋白功能的蛋白，氨基酸序列为SEQ ID NO:2。/n

【技术特征摘要】
1.一种戊型肝炎病毒ORF2蛋白，其特征在于，所述的ORF2蛋白包含有：
1)核苷酸序列为SEQIDNO:1的基因编码的蛋白；
2)在1)的蛋白上取代、缺失、添加一个或几个氨基酸，且具有1)中蛋白功能的蛋白，氨基酸序列为SEQIDNO:2。


2.一种基因，其特征在于，所述的基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭伟伟，向银辉，蔡联燊，刘新文，刘义，范根成，杜元钊，
申请(专利权)人：青岛易邦生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37