一种毡状地丝霉菌菌株及其在生物防治中的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种毡状地丝霉菌菌株及其在生物防治中的应用。所述菌株的菌种保藏号为CGMCC NO.13700。本发明专利技术还提供包含所述菌株的菌种制剂或包含所述菌株培养物的生物防治制剂。本发明专利技术还提供了所述菌株在抑制大丽轮枝菌等病原菌引起的病害或者造成的污染中的应用。采用本发明专利技术菌株对例如由大丽轮枝菌引起的黄栌枯萎病进行生物防治，可以有效降低黄栌枯萎病的发病率，抑菌率达到25％以上。

A strain of Actinomyces felt and its application in biological control

The invention provides a felted mycelium strain and its application in biological control. The strain preservation number is CGMCC no.13700. The invention also provides a strain preparation comprising the strain or a biocontrol preparation comprising the strain culture. The invention also provides the application of the strain in inhibiting diseases or pollution caused by pathogenic bacteria such as Verticillium dahliae. The bacterial strain of the invention can effectively reduce the incidence of Xanthoxylum wilt caused by e.g. Verticillium dahliae, and the bacteriostatic rate can reach more than 25%.

【技术实现步骤摘要】
一种毡状地丝霉菌菌株及其在生物防治中的应用
本专利技术涉及园林植物土传病害防治领域，尤其是涉及一种毡状地丝霉菌菌株及其在生物防治中的应用。
技术介绍
黄栌(Cotinuscoggygria)作为北京香山公园的主要红叶树种，在红叶文化的传承中具有不可替代的作用。自上世纪80年代以来，北京香山公园的黄栌林因枯萎病出现了大面积枯死现象，每年枯死的黄栌一度达到数千株，是北京城市园林生态系统建设中函待解决的难题之一(宋立洲，杜万光，李维维.香山公园黄栌枯萎病防治技术研究[J].北京园林，2011，27(2):51-56；葛雨萱，周肖红，刘洋，王亮生.黄栌属种质资源、栽培繁殖、化学成分、叶色调控研究进展.园艺学报，2014，41(9)：1833-1845.)。该病害是由大丽轮枝菌(Verticilliumdahlia)引起的系统性侵染病害，其病原菌具有广泛的寄主范围，在土壤和植物体内广泛分布，可侵染40科660种以上植物，包括农作物类、蔬菜类、水果类、观赏花卉类、纤维及油料作物和各种木本植物等，利用化学杀菌剂对其彻底清除是难以实现的，而且过量化学农药的使用对土壤微生态环境造成严重破坏，使植株长势衰弱，从而更加重了病害发生的严重度。目前对该病害的具体的防治措施主要集中在以下几个方面：(1)强调预防为主，严格控制病害扩散，强化检疫监督，严格控制带病苗木和土壤进入无病区。(2)物理防治方面，常采取土壤日晒法与生物土壤熏蒸法两种措施，但这两种物理防治方法见效缓慢。(3)化学防治中常使用溴甲烷、三氯硝基甲烷、甲基异硫氰酸酯等进行土壤熏蒸，或用植物生长调节剂缓解症状，或用苯并咪唑、苯菌灵、甲基托布津等直接注射入枝干防治(李伦光.土壤因子对黄栌枯萎病发生的影响及病害防治的初步研究[D].北京：北京林业大学，2008)。通过药剂筛选试验，韩婧等人证实萎菌净300倍和多菌灵400倍液对黄栌枯萎病的防治效果最佳(韩婧.香山黄栌枯萎病综合防治研究[D].北京：北京林业大学，2009)。然而伴随使用化学农药带来的环境污染、农药残留等严重后果，其施用力度逐渐引起争议。(4)应用拮抗菌进行生物防治为黄栌枯萎病的综合防控带来新的希望(葛瑾，颜蓉，宋立洲，等.黄栌枯萎病的综合防治策略[J].中国城市林业，2007，5(3):43-44；王建美.黄栌枯萎病病原菌及致病机理研究[D].北京：北京林业大学，2009)，但是目前拮抗菌筛选主要集中在农作物方面，而针对林木枯萎病的拮抗菌筛选则报道较少(王研.黄栌与大丽轮枝菌互作过程及病原菌定量研究[D].北京：北京林业大学，2012)。本专利技术人意外分离到了一种菌株，经鉴定，发现该菌株属于毡状地丝霉菌的变异株，并且经过试验发现，该菌株对包括大丽轮枝菌在内的众多微生物具有显著的抑制作用，于是完成了本专利技术。
技术实现思路
(一)要解决的技术问题目前对由例如大丽轮枝菌等真菌引起的病害或造成的污染采用的物理防治手段存在见效慢、化学防治措施污染大等问题，而且没有对这些真菌引起的病害或污染有效的生物防治方法。(二)技术方案为了解决上述问题，本专利技术在第一方面提供了一种毡状地丝霉菌菌株，所述菌株的菌种保藏号为CGMCCNO.13700。本专利技术在第二方面提供了一种菌种制剂，所述菌种菌剂包含具有活力的本专利技术第一方面所述的菌株。本专利技术第三方面提供了一种生物防治菌剂，所述生物防治菌剂包含由本专利技术第一方面所述的菌株培养得到的培养物。本专利技术在第四方面提供了根据本专利技术第一方面所述的菌株在生物防治中的应用。本专利技术在第五方面提供了一种分离本专利技术第一方面所述的菌株的方法，所述方法包括如下步骤：(1)马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)固体培养基的配制与制板：取去皮的新鲜马铃薯200g，加水1000ml煮沸20min，双层纱布过滤后加入葡萄糖15g，琼脂8g，补充适量的水至1000ml，充分摇匀后装入三角瓶中，121℃灭菌30min，倒入灭菌培养皿中制成平板；(2)菌株分离：将培养皿盖打开以暴露出平板，在空气中静置30min，然后盖上培养皿盖，20℃条件下培养，待不同单菌落长出后，转接到PDA固体培养基平板上继续培养成纯菌株；(3)菌株鉴定提取所述纯菌株的DNA，然后以所得DNA为模板，使用序列如SEQIDNO.1所示的通用引物ITS1和序列如SEQIDNO.2所示的通用引物ITS4进行PCR扩增，得到扩增产物并测序，确认该序列与SEQIDNO.3所示AP序列相似度达到90％以上，优选达到95％以上，更优选达到99％以上，最优选达到100％，确认所得菌株为权利要求1所述的菌株。(三)有益效果本专利技术人从冬季空气中意外地分离得到的一种真菌菌株，编号为IVD-2。经过鉴定，IVD-2菌株为毡状地丝霉菌株的变种。试验发现，该菌株对大丽轮枝菌(Verticilliumdahlia)的生长具有很强的抑制作用，抑菌率达到50％以上。利用该菌株制备生防菌粉剂或悬浮剂，在春季黄栌移栽时拌土使用时，能够有效降低黄栌枯萎病的发病率。而且，该菌株对月季黑斑病菌(Marssoninarosae)也具有极强的抑制效果，也可以用来对由月季黑斑病菌引起的病害或造成的污染进行生物防治。附图说明图1为IVD-2在PDA固体培养基上培养12天的菌落形态。图2为光学显微镜下(400X)IVD-2的分生孢子梗和分生孢子形态。图3为扫描电子显微镜下(4100X)IVD-2的分生孢子梗和分生孢子形态。图4为利用真菌rDNAITS通用引物对IVD-2扩增出的566bp的电泳条带。图中，M：核酸分子量D2000；1-10：IVD-2；11：阴性对照(双蒸水)。图5为依据IVD-2的rDNAITS1-5.8S-ITS2区域碱基序列构建的IVD-2系统进化树。图6为黄栌枯萎病菌与IVD-2对峙培养50天的菌落形态(左面为黄栌枯萎病菌，右面为IVD-2)。图7为黄栌枯萎病菌在PDA固体培养基上培养20天的菌落形态。图8为黄栌枯萎病菌在PDA固体培养基+IVD-2无菌发酵液平板上培养20天的菌落形态。图9为月季黑斑病菌在PDA固体培养基上培养15天的菌落形态。图10为月季黑斑病菌PDA固体培养基+IVD-2无菌发酵液平板上培养15天的菌落形态。图11为尖孢镰刀菌在PDA固体培养基上培养15天的菌落形态。图12为尖孢镰刀菌在PDA固体培养基+IVD-2含菌发酵液平板上上培养15天的菌落形态。图13为葡萄座腔菌与IVD-2对峙培养6天的菌落形态(左面为葡萄座腔菌，右面为IVD-2)。图14为立枯丝核菌与IVD-2对峙培养6天的菌落形态(左面为立枯丝核菌，右面为IVD-2)。图15为柳树腐烂病菌与IVD-2对峙培养6天的菌落形态(左面为柳树腐烂病菌，右面为IVD-2)图16为杨树腐烂病菌与IVD-2对峙培养6天的菌落形态(左面为杨树腐烂病菌，右面为IVD-2)具体实施方式<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种毡状地丝霉菌菌株，其特征在于，所述菌株的菌种保藏号为CGMCC NO.13700。/n

【技术特征摘要】
1.一种毡状地丝霉菌菌株，其特征在于，所述菌株的菌种保藏号为CGMCCNO.13700。


2.一种菌种制剂，其特征在于，所述菌种菌剂包含具有活力的权利要求1所述的菌株。


3.一种生物防治菌剂，其特征在于，所述生物防治菌剂包含由权利要求1所述菌株培养得到的培养物；
优选的是，所述生物防治菌剂还包括助剂和/或稳定剂；
更优选的是，所述助剂选自由聚乙二醇8000、聚乙烯醇、十二烷基硫酸钠、茶皂素和阿拉伯树胶组成的组；和/或所述稳定剂选自由碳酸钙、磷酸钾、磷酸氢二钾和羟甲基纤维素钠组成的组。


4.根据权利要求3所述的生物防治菌剂，其特征在于：
所述生物防治菌剂为悬浮剂，并且所述培养物为发酵液；
优选的是，所述发酵液通过如下方式获得：将所述菌株接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，20℃振荡培养后7天，将菌丝过滤后获得所述发酵液。


5.根据权利要求4所述的生物防治菌剂，其特征在于：在接种到马铃薯葡萄糖液体培养基之前还包括将所述菌株移植于马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基平板上进行活化的步骤。


6.根据权利要求3所述的生物防治菌剂，其特征在于：
所述生物防治菌剂为粉剂，并且所述培养物为固体培养物；
优选的是，所述固体培养物通过如下方式获得：将所述菌株接种于固体培养基例如麦麸上，20℃暗培养15天后得到固体培养物，然后将固体培养物粉碎加工至粒径为300-2500μm的程度，得到所述粉剂。


7.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：周江鸿，夏菲，车少臣，
申请(专利权)人：北京市园林科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11