达贝泊汀组合物的制造方法和达贝泊汀产生细胞的培养方法技术

本发明专利技术的目的在于提供一种对达贝泊汀生产细胞进行培养而制造达贝泊汀组合物的方法，该达贝泊汀组合物的制造方法中，达贝泊汀组合物的总产量提高，并且提高由该细胞分泌到培养液中的达贝泊汀的一分子中的唾液酸含有率。本发明专利技术涉及一种达贝泊汀组合物的制造方法，其包括：在添加有植物来源的蛋白水解物的培养基中对达贝泊汀生产细胞进行培养而得到培养液的步骤1；和从通过步骤1得到的培养液中回收达贝泊汀组合物的步骤2。

Manufacturing method of dabeprotein composition and culture method of dabeprotein producing cells

The object of the invention is to provide a method for culturing dabeprotein production cells to produce dabeprotein composition. In the manufacturing method of dabeprotein composition, the total output of dabeprotein composition is increased, and the sialic acid content of a molecule of dabeprotein secreted by the cell into the culture medium is increased. The invention relates to a manufacturing method of dabeprotein composition, which includes: Step 1 of culturing dabeprotein production cells in a culture medium added with protein hydrolysate from plant source to obtain a culture medium; and step 2 of recovering dabeprotein composition from the culture medium obtained in step 1.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】达贝泊汀组合物的制造方法和达贝泊汀产生细胞的培养方法
本专利技术涉及达贝泊汀组合物的制造方法和具有生产达贝泊汀的能力的动物细胞的培养方法等。
技术介绍
近年来，正在积极进行使用动物细胞的基因重组蛋白质等有用物质的生产，为了得到最大的产生物产量，不仅要求增加该动物细胞的该蛋白质等的表达能力本身，还要求提高该动物细胞的增殖。另一方面，即使基因重组技术在进步，仍然有难以生产的基因重组蛋白质，其中之一为糖蛋白。已知多数蛋白质以附加有糖链的糖蛋白的形式存在，其糖链结构的差异对蛋白质自身的功能产生很大影响。对于应用基因重组技术的生物药品而言，通过将人的蛋白质的基因导入到动物细胞中来进行生产。但是，在使用动物细胞来生产糖蛋白的情况下，在由该生产细胞产生的唾液酸酶等糖链分解酶等的作用下，其糖链结构变得不均匀，因此有时无法显示出充分的药效。已知作为造血因子的促红细胞生成素(EPO)具有3条N-连接型糖链和1条O-连接型糖链，血中半衰期随糖链末端的唾液酸数而变化，糖链末端的唾液酸数减少时，血中半衰期减少，几乎不显示生理活性(非专利文献1)。另外，发现了下述的达贝泊汀，其是为了进一步延长EPO的血中半衰期而改变了EPO的氨基酸序列的一部分、进而增加了唾液酸附加数而得到的(非专利文献2、专利文献1)。达贝泊汀具有5条N-连接型糖链和1条O-连接型糖链，具有持续的红细胞增加作用，与现有的EPO制剂相比能够减少给药频率，能够减轻患者的负担。但是，出于上述的原因，为了高效地生产与EPO相比具有更多的含唾液酸糖链的均匀的达贝泊汀，在提高产量的同时要求更高的糖链调控技术。作为糖链调控方法，已知下述方法：为了抑制由分泌到培养液中的糖链分解酶所致的唾液酸从糖蛋白的脱离，将例如作为唾液酸酶抑制剂的2-脱氧-2,3-脱氢-N-乙酰神经氨酸(NeuAc2en)等低分子化合物添加到培养基中而进行培养。另一方面，为了提高动物细胞的增殖和由该动物细胞产生的物质的产量，以往在对该动物细胞进行培养时使用的培养基中添加白蛋白、转铁蛋白或胰岛素之类的、血清或来源于血清的物质、来源于动物的蛋白质。向培养基中添加血清或来源于血清的物质、来源于动物的蛋白质时，存在细胞培养物和由其中得到的产生物质被肝炎、病毒或牛海绵状脑病(BSE)等污染的风险，因此，对不含有血清或来源于血清的物质和来源于动物的蛋白质的完全合成培养基(化学限定培养基，chemicallydefinedmedium)进行了开发。作为典型的完全合成培养基的构成成分，可以列举氨基酸、有机盐或无机盐、维生素、矿物质、微量金属、糖、脂质和核酸等，已知通过在完全合成培养基中添加来源于大豆等植物的蛋白水解物，能够与含血清培养基同等程度地提高动物细胞的增殖和由该动物细胞得到的产生物质的产量(专利文献2、3)。现有技术文献专利文献专利文献1：日本专利第2938572号说明书专利文献2：国际公开第2001/023527号专利文献3：国际公开第2006/045438号非专利文献非专利文献1：GlycoconjugateJ.,1993；10；263非专利文献2：Nephrol.Dial.Transplant.,2001；16；3-13
技术实现思路
专利技术所要解决的课题但是，还不知道提高达贝泊汀组合物的总产量、并且提高由该细胞分泌到培养液中的达贝泊汀的一分子中的唾液酸含有率的方法。因此，本专利技术的目的在于提供一种对达贝泊汀生产细胞进行培养而制造唾液酸附加数高的达贝泊汀组合物的方法，该达贝泊汀组合物的制造方法提高由该细胞分泌到培养液中的达贝泊汀组合物的总产量，并且提高由该细胞分泌到培养液中的达贝泊汀的一分子中的唾液酸含有率。用于解决课题的手段本专利技术人发现，通过使用含有植物来源的蛋白水解物的培养基对达贝泊汀生产细胞进行培养，由该细胞分泌到培养液中的达贝泊汀组合物的总产量提高，并且，通过抑制分泌到培养液中的唾液酸酶，由该细胞分泌到培养液中的达贝泊汀的一分子中的唾液酸附加率提高，能够显著地生产唾液酸附加数高的达贝泊汀组合物，从而完成了本专利技术。即，本专利技术提供下述(1)～(19)。(1)一种达贝泊汀组合物的制造方法，其包括下述步骤1和步骤2，步骤1：在添加有植物来源的蛋白水解物的培养基中对达贝泊汀生产细胞进行培养而得到培养液的步骤；步骤2：从步骤1中得到的培养液中回收达贝泊汀组合物的步骤。(2)一种抑制了唾液酸从达贝泊汀分子脱离的达贝泊汀组合物的制造方法，其包括下述步骤1和步骤2，步骤1：在添加有植物来源的蛋白水解物的培养基中对达贝泊汀生产细胞进行培养而得到培养液的步骤；步骤2：从步骤1中得到的培养液中回收达贝泊汀组合物的步骤。(3)如(1)或(2)所述的制造方法，其中，步骤1中得到的培养液中的每一分子达贝泊汀含有12～22个唾液酸的达贝泊汀组合物的67％以上为每一分子达贝泊汀含有18～22个唾液酸的达贝泊汀组合物。(4)如(1)～(3)中任一项所述的制造方法，其中，步骤1中得到的培养液中的每一分子达贝泊汀含有12～22个唾液酸的达贝泊汀组合物的55％以上为每一分子达贝泊汀含有19～22个唾液酸的达贝泊汀组合物。(5)如(1)～(4)中任一项所述的制造方法，其中，步骤1中得到的培养液中的每一分子达贝泊汀含有12～22个唾液酸的达贝泊汀组合物的44％以上为每一分子达贝泊汀含有20～22个唾液酸的达贝泊汀组合物。(6)如(1)～(5)中任一项所述的制造方法，其中，步骤1中得到的培养液中的每一分子达贝泊汀含有12～22个唾液酸的达贝泊汀组合物的18％以上为每一分子达贝泊汀含有22个唾液酸的达贝泊汀组合物。(7)如(1)～(6)中任一项所述的制造方法，其中，步骤1中得到的培养液中的达贝泊汀组合物的总产量比在不含有植物来源的蛋白水解物的培养基中培养时高。(8)如(1)～(7)中任一项所述的制造方法，其中，达贝泊汀生产细胞为在宿主细胞中导入含有编码达贝泊汀的基因的载体而得到的转化细胞。(9)如(8)所述的制造方法，其中，宿主细胞为动物细胞。(10)如(9)所述的制造方法，其中，动物细胞为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、小鼠黑色素瘤(NS0)细胞或小鼠骨髓瘤(SP2/0)细胞、或者来源于这些细胞的细胞。(11)如(1)～(10)中任一项所述的制造方法，其中，添加植物来源的蛋白水解物的培养基为完全合成培养基。(12)如(1)～(11)中任一项所述的制造方法，其中，向培养基中添加的植物来源的蛋白水解物的浓度为1～5g/l。(13)如(1)～(12)中任一项所述的制造方法，其中，植物来源的蛋白水解物为来源于大豆的蛋白水解物。(14)如(1)～(13)中任一项所述的制造方法，其中，进一步包括对达贝泊汀组合物进行纯化的纯化步骤。(15)如(14)所述的制造方法，其中，纯化步骤本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种达贝泊汀组合物的制造方法，其包括下述步骤1和步骤2，/n步骤1：在添加有植物来源的蛋白水解物的培养基中对达贝泊汀生产细胞进行培养而得到培养液的步骤；/n步骤2：从步骤1中得到的培养液中回收达贝泊汀组合物的步骤。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170303 JP 2017-0407471.一种达贝泊汀组合物的制造方法，其包括下述步骤1和步骤2，
步骤1：在添加有植物来源的蛋白水解物的培养基中对达贝泊汀生产细胞进行培养而得到培养液的步骤；
步骤2：从步骤1中得到的培养液中回收达贝泊汀组合物的步骤。


2.一种抑制了唾液酸从达贝泊汀分子脱离的达贝泊汀组合物的制造方法，其包括下述步骤1和步骤2，
步骤1：在添加有植物来源的蛋白水解物的培养基中对达贝泊汀生产细胞进行培养而得到培养液的步骤；
步骤2：从步骤1中得到的培养液中回收达贝泊汀组合物的步骤。


3.如权利要求1或2所述的制造方法，其中，步骤1中得到的培养液中的每一分子达贝泊汀含有12～22个唾液酸的达贝泊汀组合物的67％以上为每一分子达贝泊汀含有18～22个唾液酸的达贝泊汀组合物。


4.如权利要求1～3中任一项所述的制造方法，其中，步骤1中得到的培养液中的每一分子达贝泊汀含有12～22个唾液酸的达贝泊汀组合物的55％以上为每一分子达贝泊汀含有19～22个唾液酸的达贝泊汀组合物。


5.如权利要求1～4中任一项所述的制造方法，其中，步骤1中得到的培养液中的每一分子达贝泊汀含有12～22个唾液酸的达贝泊汀组合物的44％以上为每一分子达贝泊汀含有20～22个唾液酸的达贝泊汀组合物。


6.如权利要求1～5中任一项所述的制造方法，其中，步骤1中得到的培养液中的每一分子达贝泊汀含有12～22个唾液酸的达贝泊汀组合物的18％以上为每一分子达贝泊汀含有22个唾液酸的达贝泊汀组合物。


7.如权利要求1～6中任一项所述的制造方法，其中，步骤1中得到的培养液中的达贝泊汀组合物的总产量比在不含有植物来源的蛋白水解物的培养基中培养时高。


8.如权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：塚原正义，山本耕一，石原尚，细野真礼登，中川泰志郎，奥村直史，矶田智子，
申请(专利权)人：协和麒麟株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP