LsH3在黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染下瓠瓜分析中作为内参基因的用途制造技术

本发明专利技术属于分子生物学技术领域，具体涉及LsH3基因在黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染下瓠瓜叶片或果实qRT‑PCR分析中作为内参基因的用途。本发明专利技术利用瓠瓜转录组数据，在全基因组水平上比较了基因的表达水平和稳定性，并通过使用LsIPT或LsDdRP基因进行验证，确定所揭示的LsH3基因在黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染下瓠瓜叶片和果实中均能稳定表达，是瓠瓜在黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染下利用qRT‑PCR技术检测基因表达分析的可靠内参基因。本发明专利技术首次将LsH3基因作为内参基因用于瓠瓜基因表达分析，解决了现有瓠瓜定量PCR检测中没有内参基因的现状。

The application of lsh3 as internal reference gene in the analysis of bottle gourd infected by cucumber green mottle mosaic virus

The invention belongs to the field of molecular biology technology, in particular to the use of lsh3 gene as an internal reference gene in QRT \u2011 PCR analysis of leaves or fruits of bottle gourd infected by cucumber green mottle mosaic virus. In the invention, the expression level and stability of genes are compared at the whole genome level by using the transcriptome data of bottle gourd, and the lsh3 gene disclosed can be stably expressed in the leaves and fruits of bottle gourd under the infection of Cucumber green mottle mosaic virus through the verification of lsipt or lsddrp gene, which is the QRT \u2011 PCR technology detection base of bottle gourd under the infection of Cucumber green mottle mosaic virus Reliable internal reference gene for expression analysis. The invention uses lsh3 gene as internal reference gene for gene expression analysis of bottle gourd for the first time, and solves the current situation that there is no internal reference gene in quantitative PCR detection of bottle gourd.

【技术实现步骤摘要】
LsH3在黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染下瓠瓜分析中作为内参基因的用途
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种基因在黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染下瓠瓜叶片或果实qRT-PCR分析中作为内参基因的用途。
技术介绍
瓠瓜(Lagenariasicerariavar.hispida)，为葫芦科葫芦属一年生蔓性草本，是可消肿结、润肌肤的药用瓜菜。中国自古就有栽培，嫩果是民间夏令常吃的佳肴，口感细嫩柔软，稍有甜味，去皮后全可食用。成熟老果不可食用，中国古时以其老熟干燥果壳作容器，也作药用。瓠瓜在我国南北各地均有栽培，南方栽培普遍，近几年北方也开始引种栽培。近年来，随着西瓜上黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumbergreenmottlemosaicvirus,CGMMV)的发生危害频频报道，作为西瓜砧木的瓠瓜携带CGMMV的病例也有大量报道。CGMMV侵染西瓜导致新叶产生淡绿色或淡黄色的花斑，而后形成绿色的突起，甚至使叶片产生畸形。随着病叶老化，症状逐渐减弱，与正常植株相比，病株生长缓慢，植株矮小，有时还出现萎蔫症状。有时感病西瓜果实的表面出现镶嵌斑驳或是颜色浓绿的圆斑，其中央还会可能产生坏死点。有时感病西瓜果实表面没有症状，但果实内部，靠近种子的果肉呈褐紫色的浑浊而不透明的水浸状，果肉出现纤维化，甚至出现空洞、腐烂。而CGMMV侵染的瓠瓜叶片表现为黄化、花叶或是脉间黄化沿叶脉呈绿带状，有时伴随绿色突起。一般病株顶部叶片表现为黄化、花叶、绿色突起、变小，底部叶片沿叶脉皱缩，叶边缘呈现波浪状，叶片畸形，有时老叶也会出现隐症。幼果感病后，果实表面表现斑驳或是绿色部分突起等症状，待果实成熟后症状消失，病果果梗出现褐色坏死。CGMMV侵染不同寄主叶片表现症状类似，但在果实上则差异较大的现象引起了人们的关注。目前对葫芦科作物的功能基因研究仍比较落后，在瓠瓜功能基因研究中利用qRT-PCR分析基因表达的研究尚未见报道，仅在甜瓜和西瓜等近源物种中针对生物或非生物胁迫、果实发育等阶段有少量应用传统内参基因的相关报道。因此目前对CGMMV侵染后瓠瓜叶片和果实基因进行表达分析时，只能参考其他物种选用表达稳定性缺乏系统验证的传统内参基因，这严重影响了瓠瓜在被病毒侵染后叶片和果实中基因表达分析的准确性。而近年来兴起的转录组测序技术，为我们筛选CGMMV侵染后瓠瓜叶片中稳定表达的内参基因提供了可能。这就需要提供葫芦科植物在作为黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染下的专属内参基因，为准确监测、预防该病提供可能。
技术实现思路
本申请以CGMMV侵染前后的瓠瓜为试验材料，检测候选持家基因和葫芦科传统内参基因在瓠瓜叶片和果实中基因表达情况，揭示候选基因在黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染下瓠瓜叶片或果实qRT-PCR分析中作为内参基因的用途。为解决瓠瓜在被黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染后叶片或果实中进行基因表达定量分析时缺乏经系统验证、表达稳定的内参基因的问题。本专利技术的目的之一在于提供一种LsH3基因在黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染下瓠瓜叶片或果实qRT-PCR分析中作为内参基因的用途。在一些优选的方式中，所述的LsH3基因序列如SEQIDNo.1所示。在一些优选的方式中，所述的内参基因的引物为：正向引物序列：CAAACTGCCCGTAAGTCCAC；反向引物序列：GGCTTCTTCACTCCTCCTGT。另一方面，本专利技术提供一种黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染下瓠瓜叶片或果实qRT-PCR分析LsIPT或LsDdRP的方法，包括如下步骤：步骤1：供试样品处理瓠瓜幼苗种植于温室土壤中，保持温度20-25℃，每3天浇一次水，在两叶一心期将黄瓜绿斑驳花叶病毒病汁液摩擦接种于展开的系统叶片；病汁液是通过将100mg黄瓜绿斑驳花叶病毒感病组织匀浆于20倍体积的PBS缓冲液中所形成；健康植株用PBS缓冲液处理作为对照；随机选取黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染的瓠瓜系统叶片、果实和健康瓠瓜系统叶片、果实于液氮中保存备用；步骤2：RNA的提取和cDNA的合成将液氮中保存备用的供试样品进行RNA提取，每个处理设置3次生物学重复；用变性凝胶电泳和生物分析仪检测RNA质量和浓度；对上述每个RNA进行反转录得到对应的cDNA；步骤3：提供参考基因LsIPT或LsDdRP的引物；LsIPT引物的核苷酸序列如下：正向引物序列为GCACTCCAATGGCTCGTTTA，反向引物序列为GGTCGATGGTGGATTTGTCG；LsDdRP引物的核苷酸序列如下：正向引物序列为AAACTCCCTTTCAGCCTCGA，反向引物序列为AGATGTGGCCCTGTTGAGAA；提供内参基因LsH3的引物，LsH3引物的核苷酸序列如下：正向引物序列为CAAACTGCCCGTAAGTCCAC；反向引物序列为GGCTTCTTCACTCCTCCTGT；步骤4：qRT-PCT分析将已合成的cDNA溶液稀释5倍作为qRT-PCR的初始浓度；10μLqRT-PCR反应体系包含5μL的2×SYBRPremixExTaqTM溶液，0.5μL的cDNA溶液，上下游检测引物(参考基因：LsIPT或LsDdRP；内参基因LsH3)各0.15μL，3.9μL的RNaseFreedH2O。反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性15sec，58℃退火15sec，72℃延伸15sec，40个循环；每个样品设置3次重复；若参考基因LsIPT或LsDdRP在待测瓠瓜叶片或果实中的表达模式为上调表达，表达量提高，则表明LsH3适合作为CGMMV侵染瓠瓜叶片或果实的内参基因。本专利技术具有的有益技术效果为：表达稳定性高:本专利技术利用瓠瓜转录组数据，在全基因组水平上比较了CGMMV侵染后瓠瓜叶片和果实中基因的表达水平和稳定性，并从中筛选出了合适的新的内参基因，而传统的内参基因在转录组分析中表达水平和稳定性不高。因此，本专利技术获得的内参基因的表达稳定性要优于目前使用的传统内参基因。使用范围广：本专利技术分析了内参基因在瓠瓜叶片和果实2种不同组织及健康和感染CGMMV瓠瓜中的表达稳定性，获得的内参基因具有较广泛的适用性。附图说明图1是瓠瓜叶片和果实候选内参基因PCR扩增结果电泳图，其中，图A)表示叶片候选内参基因PCR扩增结果图；图B)表示叶片和果实共同候选内参基因PCR扩增结果图以及果实候选内参基因PCR扩增结果图。图2是瓠瓜叶片和果实候选内参基因的溶解曲线分析，其中A)图表示叶片和果实共同候选内参基因溶解曲线；B)图表示叶片候选内参基因溶解曲线；C)图表示果实候选内参基因溶解曲线。图3是瓠瓜叶片和果实候选内参基因在所有样品组中原始Ct值分布箱形图，其中，图A)表示瓠瓜叶片候选内参基因原始Ct值分布箱形图；图B)表示瓠瓜果实候选内参基因原始Ct值分布箱形图；图C)表示瓠瓜叶片和果实共同候选内参基因原始Ct值分布箱形图。图4是geNorm分析CGMMV侵染瓠瓜叶片和果实共同候选内参基因稳定性M图。图5是geNorm分析CGMMV侵染瓠瓜叶片和果实共同候选内参基因稳定性V图。图6是NormFinder软件分析瓠瓜叶片和果实共同候选内参基因稳定性。图7是geNorm分析CGMMV侵染瓠瓜叶片候选基因稳定性M图。图8是geNorm分析CGMMV侵染瓠瓜叶片候选基因稳定性V图。图9是NormFinder分本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.LsH3在黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染下瓠瓜叶片或果实qRT‑PCR分析中作为内参基因的用途。

【技术特征摘要】
1.LsH3在黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染下瓠瓜叶片或果实qRT-PCR分析中作为内参基因的用途。2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的内参基因LsH3的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。3.一种黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染下瓠瓜叶片或果实qRT-PCR分析LsIPT或LsDdRP的方法，其特征在于，它包括如下步骤：步骤1：供试样品处理瓠瓜幼苗种植于温室土壤中，保持温度20-25℃，每3天浇一次水，在两叶一心期将黄瓜绿斑驳花叶病毒病汁液摩擦接种于展开的系统叶片；病汁液是通过将100mg黄瓜绿斑驳花叶病毒感病组织匀浆于20倍体积的PBS缓冲液中所形成；健康植株用PBS缓冲液处理作为对照；随机选取黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染的瓠瓜系统叶片、果实和健康瓠瓜系统叶片、果实于液氮中保存备用；步骤2：RNA的提取和cDNA的合成将液氮中保存备用的供试样品进行RNA提取，每个处理设置3次生物学重复；用变性凝胶电泳和生物分析仪检测RNA质量和浓度；对上述每个RNA进行反转录得到对应的cDNA；步骤3：提供参考基因LsIPT或LsDdRP的引...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑红英，燕飞，张趁华，吴昕扬，彭杰军，鲁宇文，林林，陈剑平，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：浙江,33