利用聚乙烯亚胺定量检测对苯二酚和β-葡萄糖苷酶的方法技术

本发明专利技术公开了一种以聚乙烯亚胺定量检测对苯二酚和β‑葡萄糖苷酶的方法。β‑葡萄糖苷酶可水解β‑熊果苷产生对苯二酚，对苯二酚可与超支化聚乙烯亚胺交联并形成水溶性荧光聚合物纳米颗粒，生成荧光聚合物纳米颗粒的荧光强度与对苯二酚的浓度或者参加水解过程中的β‑葡萄糖苷酶的活性成正比，当对苯二酚的浓度在0～2.5μM或者β‑葡萄糖苷酶的浓度在1～36U L

Quantitative determination of hydroquinone and \u03b2 - glucosidase by polyethyleneimine

【技术实现步骤摘要】
利用聚乙烯亚胺定量检测对苯二酚和β-葡萄糖苷酶的方法
本专利技术属于荧光检测
，具体涉及一种利用聚乙烯亚胺定量检测对苯二酚和β-葡萄糖苷酶的方法。
技术介绍
β-葡萄糖苷酶(β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，E.C.3.2.1.21)是糖苷水解酶家族中的一大类酶，其主要功能是水解结合于底物末端非还原性的β-D-葡萄糖苷键，同时释放出β-D-葡萄糖和相应的配基。β-葡萄糖苷酶在土壤，微生物，植物，哺乳动物和人类中含量丰富，它们在生物过程中起重要作用。β-葡萄糖苷酶的活性通常用作指示以证明生物体的定性变化。据报道，它是新生儿坏死性小肠结肠炎早期诊断的潜在生物标志物，也是克服乳腺癌化疗耐药性的替代治疗策略。β-葡萄糖苷酶在疾病的诊断、治疗中发挥着重要作用。此外，β-葡萄糖苷酶在食品工业中起着重要作用。β-葡萄糖苷酶被用来使蔬菜、水果、茶叶等食物产生增香作用。并且这些酶可以从大豆产品中存在的糖基化的类黄酮中除去糖苷部分，获得其有益健康效果。此外，β-葡萄糖苷酶还是一种用于改善食品风味的重要酶制剂，广泛应用于食品、药品、保健品等领域。β-葡萄糖苷酶还在组分的生物转化和果汁和葡萄酒的风味增强中起重要作用。因此，开发灵敏可靠的方法来测定β-葡萄糖苷酶活性具有重要意义。目前，β-葡萄糖苷酶的检测方法主要有分光光度比色法和荧光光谱法。传统的比色测定法由于易受干扰，其灵敏度通常非常有限。相较之下，荧光测定具有快速响应，高灵敏度和简单操作优点，近年来引起了更多关注。开发一种具有灵敏度高选择性好的基于荧光光谱法测定β-葡萄糖苷酶活性具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种以聚乙烯亚胺定量检测对苯二酚和β-葡萄糖苷酶的方法。该方法操作简单，检测限低，灵敏度高，选择性好，能快速实时的对对苯二酚浓度及β-葡萄糖苷酶的活性进行检测本专利技术采取的技术方案为：本专利技术首先提供了聚乙烯亚胺在定量检测对苯二酚和β-葡萄糖苷酶中的应用。β-葡萄糖苷酶可水解β-熊果苷产生对苯二酚，对苯二酚可与超支化聚乙烯亚胺(PEI)交联并形成水溶性荧光聚合物纳米颗粒(FPNs)，生成荧光聚合物纳米颗粒(FPNs)的荧光强度与对苯二酚的浓度或者参加水解过程中的β-葡萄糖苷酶的活性成正比，当对苯二酚的浓度在0～2.5μM或者β-葡萄糖苷酶的浓度在1～36UL-1范围时，体系在510nm处的荧光强度与对苯二酚的浓度或β-葡萄糖苷酶活性呈良好的线性关系，进而可利用聚乙烯亚胺实现对于对苯二酚及β-葡萄糖苷酶活性的定量检测。本专利技术还提供了一种对苯二酚的定量检测方法，所述检测方法包括以下步骤：(1)向聚乙烯亚胺溶液和磷酸盐缓冲溶液的混合液中，加入一系列不同浓度的对苯二酚溶液，反应之后，在373nm的激发波长下检测体系的荧光光谱；(2)以对苯二酚溶液的浓度为横坐标，体系在510nm处的荧光强度为纵坐标构建标准曲线，进而定量检测出对苯二酚的浓度。进一步地，步骤(1)中，聚乙烯亚胺溶液、磷酸盐缓冲溶液的终浓度分别为0.29g/L～0.37g/L、18mM～22mM，分别优选为0.33g/L、20mM；所述磷酸盐缓冲溶液的pH为8.0～10.0，优选为8.2。步骤(1)中，对苯二酚溶液的终浓度分别为0、0.05、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.1，2.4、2.7、3.0、3.3、3.6、3.9、4.2、4.5、6.5、9.0、12.0、15.0μM。步骤(1)中，所述反应的条件为55～65℃反应85～95分钟，优选为60℃反应90分钟。更进一步地，所述对苯二酚的定量检测方法具体包括以下步骤：(1)将300μL、2.2gL-1PEI的溶液与1.0mLpH＝8.2的40mM磷酸盐缓冲溶液混合，然后向混合液中加入700μL含有特定浓度对苯二酚的溶液，以使对苯二酚溶液的终浓度分别为0、0.05、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.1，2.4、2.7、3.0、3.3、3.6、3.9、4.2、4.5、6.5、9.0、12.0、15.0μM，然后保持在60℃持续90分钟，在373nm的激发波长下检测体系的荧光光谱；(2)以对苯二酚溶液的浓度为横坐标，体系在510nm波长处的荧光强度为纵坐标构建标准曲线，进而定量检测出对苯二酚的浓度。进一步地，所述步骤(2)中，所述标准曲线的线性方程为F＝104.5+1464.9C，其线性相关系数R2＝0.996，其中F为510nm波长处的荧光强度，C为对苯二酚的浓度，单位为μM，该方法的检测限为0.02μM。本专利技术还提供了一种β-葡萄糖苷酶活性的检测方法，包括以下步骤：A、分别使用不同浓度的β-葡萄糖苷酶水解β-熊果苷，得到水解液；B、分别向步骤A得到的水解液中加入聚乙烯亚胺溶液和磷酸盐缓冲溶液的混合液，孵育之后，在373nm的激发波长下检测体系的荧光光谱；C、以β-葡萄糖苷酶的浓度为横坐标，体系在510nm波长处的荧光强度为纵坐标构建标准曲线，进而定量检测出β-葡萄糖苷酶的活性。进一步地，β-熊果苷、聚乙烯亚胺溶液在体系中的终浓度分别为47μM～53μM，0.29g/L～0.37g/L，并分别优选为50μM、0.33g/L；进一步地，所述步骤A具体包括以下步骤：将β-熊果苷溶液与磷酸盐缓冲液混合，然后向混合物中加入不同浓度的β-葡萄糖苷酶，在38～42℃反应56～64分钟，优选为40℃温育60分钟。所述步骤A中的磷酸盐缓冲液的pH为6.5-7.0，优选为6.5。更进一步地，所述步骤A具体包括以下步骤：将100μL、1.0mMβ-熊果苷溶液与100μL的pH＝6.5的40mM磷酸盐缓冲液混合，然后向混合物中加入500μL不同浓度的β-葡萄糖苷酶，以使体系中β-葡萄糖苷酶的终浓度分别为0、1、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、50、60、70、80、90、100UL-1，在40℃下温育60分钟。所述步骤B中，所述磷酸盐缓冲溶液的pH为8.0～10.0，优选为8.2。所述步骤B中，孵育的条件为：55～65℃反应85～95分钟，优选为60℃孵育90分钟。进一步地，所述步骤B具体包括以下步骤：分别向步骤A得到的水解液中加入300μL、2.2gL-1PEI溶液和1.0mLpH＝8.2的40mM磷酸盐缓冲溶液的混合溶液，将其在60℃孵育90分钟，在373nm的激发波长下检测体系的荧光光谱。进一步地，所述步骤C中，所述标准曲线的线性方程为F＝–57.8+116.6C，其线性相关系数R2＝0.994，其中F为510nm波长处的荧光强度，C为β-葡萄糖苷酶的浓度，单位为UL-1，该方法的检测限为0.4UL-1。本专利技术提供的技术方案中，超支化聚乙烯亚胺(PEI)是一种树枝状聚合物，在主链和支链中都含有丰富的活性胺基。酚类化合物很容易在碱性条件下被空气中的氧气氧化，当将PEI加入到对苯二酚溶液中时，对苯二酚被氧化成对苯醌。对苯醌容易与PEI上的胺基发生席夫碱缩合反应，这是含有酮和氨基的化合物之间的反应，这种缩合反应使PEI高分子链间或PEI高分子链内发生交联，得到含有C＝N键的产物。由于交联作用使分子量变大，在水溶液中形成纳米颗粒，另一方面大量的C＝N键固定在纳米颗粒中具有较强的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.聚乙烯亚胺在定量检测对苯二酚和β‑葡萄糖苷酶中的应用。

【技术特征摘要】
1.聚乙烯亚胺在定量检测对苯二酚和β-葡萄糖苷酶中的应用。2.一种对苯二酚的定量检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：(1)向聚乙烯亚胺溶液和磷酸盐缓冲溶液的混合液中，加入一系列不同浓度的对苯二酚溶液，反应之后，在373nm的激发波长下检测体系的荧光光谱；(2)以对苯二酚溶液的浓度为横坐标，体系在510nm波长处的荧光强度为纵坐标构建标准曲线，进而定量检测出对苯二酚的浓度。3.根据权利要求2所述的对苯二酚的定量检测方法，其特征在于，步骤(1)中，聚乙烯亚胺溶液、磷酸盐缓冲溶液的终浓度分别为0.29g/L～0.37g/L、18mM～22mM；所述磷酸盐缓冲溶液的pH为8.0～10.0。4.根据权利要求2所述的对苯二酚的定量检测方法，其特征在于，步骤(1)中，对苯二酚溶液的终浓度分别为0、0.05、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.1，2.4、2.7、3.0、3.3、3.6、3.9、4.2、4.5、6.5、9.0、12.0、15.0μM。5.根据权利要求2所述的对苯二酚的定量检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述反应的条件为55～65℃反应85～95分钟。6.一种β-葡萄糖苷酶活性的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：A、分别使用不同浓度的β-葡萄糖苷酶水解β-熊果苷，得...

【专利技术属性】
技术研发人员：台德艳，鲍慧娟，刘金水，
申请(专利权)人：安徽师范大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34