一种抗原固定化基质膜及包含其的用于检测自身免疫疾病相关抗核抗体谱的试剂盒及其用途制造技术

本发明专利技术公开了一种抗原固定化基质膜及包含其的用于检测自身免疫疾病相关抗核抗体谱的试剂盒及其用途。所述的抗原固定化基质膜包含但不仅包含以下22条彼此独立的抗原检测线，所述的抗原检测线由双链DNA、组蛋白、核糖体P0蛋白、PCNA、SmD1、SmD3、SmB/B’、snRNP‑A、snRNP‑C、snRNP68/70、SSA/Ro60、SSA/Ro52、SSB/La、Jo‑1、PL‑7、PL‑12、PmScl、Scl‑70、CENP‑A、CENP‑B、RA33以及PR3组成。利用包含该抗原固定化基质膜的试剂盒进行检测，能够同时检测22种自身免疫抗体，用以辅助诊断8种常见弥散性结缔组织病。

【技术实现步骤摘要】
一种抗原固定化基质膜及包含其的用于检测自身免疫疾病相关抗核抗体谱的试剂盒及其用途
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种抗原固定化基质膜及包含其的用于检测自身免疫疾病相关抗核抗体谱的试剂盒及其用途。
技术介绍
自身免疫性疾病(AutoimmuneDiseases)是由于机体免疫系统对自身存在的抗原发生免疫反应，进而导致自身器官组织损害的一类疾病。其发病过程涉及自身抗原的暴露、机体促炎症的微环境、先天免疫系统的激活、抗原呈递反应激活获得性免疫系统、T细胞的激活以及B细胞释放出大量抗自身抗体等等病理机制。随着免疫系统的层级紊乱和对释放自身抗原的组织或器官的进一步攻击和损害，最终导致器质性病变，亦即自身免疫性疾病的发生。基于自身免疫类疾病的特殊病理机制可知，自身免疫反应的发生早于该疾病临床表征的出现。不同的自身免疫性疾病，致病性自身抗原的种类各异，故B细胞所产生的抗自身抗原的抗体也具有疾病特异性。因此，检测血液中的特异性自身抗体，就成为对自免类疾病进行风险预测、早期诊断的重要免疫学指标。自身免疫性疾病可发作于人体的任何器官及组织。至今，已临床发现超过100种不同的自免类疾病。根据世界卫生组织(WorldHealthOrganization,WHO)的权威报道，自身免疫性疾病在人群中的发病率约占总人数的3-5％。在中国，罹患此类疾病的患者数目高达6000万人以上。自身免疫性疾病好发于女性和中老年人，其特点是起病缓慢，病程反复迁徙，反复发作，反复缓解，有的成为终生痼疾。目前临床实验室使用的自身抗体免疫学检测方法包括免疫荧光法、酶联免疫吸附法和免疫印迹法，不同方法各有优劣。免疫荧光法是使用具有完全自身抗原谱的人喉癌上皮细胞Hep-2或鼠肝或鼠肾的细胞冰冻切片为基质。加入血清检测时，血清中的自免抗体可特异性结合于天然抗原上，再通过荧光染色的方法提示自身抗体的存在，属于定性的检测方法。根据抗体所结合的自身抗原的亚细胞定位，其染色图谱可大致分为：均质核型、着丝点核型、核膜核型、核仁核型、斑点核型以及胞浆型六大类。这种方法的优点是利用细胞所含的天然抗原进行自身抗体检测，抗原谱完全，且抗原结构均为天然构像，其检测的特异性最高。缺点是操作复杂，且定性结果判定具有主观性，可能因为疾病进程的不同、观察者的不同以及新老切片批次不同的差异而对染色结果释义存在差异。同时，该方法无法通过荧光图谱确定阳性自身抗体的具体种类，因此无法对不同种类的疾病进行特异性鉴别诊断。酶联免疫吸附法是将某一特定种类的自身抗原吸附于酶标板上。孵育血清后，抗原与血清中自身抗体特异性结合，再通过酶联反应显色的一种定量检测手段。它具有灵敏度高、特异性强、操作方法简便、应用范围广等特点。同时，可针对单类自免抗体进行特异性定量检测，排除了诊断结果释义中的主观偏差。但是，单次酶联免疫测试只能检测单一的自免抗体，检测通量低成本高，在自身免疫性疾病的辅助诊断应用推广方面具有很大的局限性。免疫印迹法是基于固相免疫测定技术的一种检测方法。其原理是通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)将HEP-2细胞裂解物进行电泳分离，进而确定不同的自身抗原在电泳图谱上的位置，再通过电转移的方式将完全抗原谱从凝胶转移至硝酸纤维膜或尼龙膜。孵育血清后，血清中的自身抗体与固相膜上的抗原进行特异性结合，再通过不同的信号检测方式，如碱性磷酸酶显色或化学发光等，对自免抗体进行半定量或定量检测。固相免疫测定技术本身具有高特异性和高敏感性的优点。但凝胶电泳分离技术只可通过分子量大小粗略分离抗原，无法精确定位不同抗原在膜上的位置，对于检出抗体的具体种类的判别具有主观性。同时，该技术也无法排除非抗原蛋白的存在，因此无法判别阳性检出信号是特异性还是非特异性的结果。另外，在凝胶电泳过程中，十二烷基磺酸钠等变性剂的加入会不同程度地破坏抗原决定簇的天然构像，导致无法识别特异性自免抗体或发生非特异性结合，造成假阳性或假阴性结果，影响后续诊断。随着蛋白工程技术的发展，免疫印迹法得到了进一步的改良。通过不同的蛋白表达系统，可表达纯化得到特定的高纯度重组抗原蛋白，再通过点样或划线的方法，将重组抗原包被于硝酸纤维膜或尼龙膜的某一确定位置，进而对特异性自免抗体进行检测。改进后的免疫印迹法避免了天然抗原被变性及构像破坏，并可根据不同抗原在膜上的准确位置精准判读检出的自免抗体种类。弥散性结缔组织病泛指就诊于风湿免疫科的一大类自身免疫疾病的集合，是以疏松结缔组织黏液样水肿及纤维蛋白样变性为病理基础的一组疾病。其中包括系统性红斑狼疮、干燥综合征、混合型结缔组织病、皮肌炎、多肌炎、硬皮病、风湿性关节炎、韦格纳肉芽肿等。此组疾病包含多种临床及病理学方面的共同点，如多系统同时受累(皮肤、肌肉、关节、心脏、肾脏、造血系统、中枢神经系统等)，可伴发热、关节痛、雷诺现象、血管炎、血沉增快、γ免疫球蛋白增高等表象，且病程长变化多；但又各具有特征性的表现。该类疾病的致病性抗原多为细胞核内蛋白，故所产生的自身抗体多为抗核抗体。由于该类疾病发病机制上的内部相关性，常出现多种疾病伴随发生的重叠现象。由于特征性临床表象多在病程中晚期才逐渐出现，针对特异性抗核抗体的免疫学检测就成为该类疾病早期诊断的有力工具。根据中华医学会风湿病学分会的诊治指南，不同的弥散性结缔组织病可使用各自特异的一种或几种抗核抗体作为诊断指标或辅助性诊断指标。例如，检出阳性的抗dsDNA，抗SmD1、抗SmD3、抗SmB/B’、抗组蛋白(H2A、H2B、H3以及H4)、抗核糖体P蛋白、抗增殖细胞核抗原等自免抗体是诊断系统性红斑狼疮的免疫学指标；阳性抗SSA/Ro60、抗SSA/Ro52、抗SSB/La等抗体为干燥综合征的诊断指标；抗snRNPA、抗snRNPC和抗snRNP68/70等抗体为混合型结缔组织病诊断指标；抗Jo-1、抗PL-7、抗PL-12及抗PmScl等抗体阳性为皮肌炎多肌炎的辅助诊断指标；抗Scl-70等1种抗体为系统性硬化症指标；抗CENP-A及抗CENP-B等抗体为局限性硬皮病指标；抗RA33、抗CCP、抗RF等抗体为风湿性关节炎特异性指标；抗PR3、抗MPO等抗体为韦格纳肉芽肿的免疫学指标。但由于多种弥散性结缔组织病之间发病机理相互关联，血清免疫学诊断指标的运用也相较其他类型疾病更为复杂，例如：1)不同抗核抗体在同种疾病中的阳性率有所不同，如抗Jo-1抗体在肌炎病人中阳性率仅为10-30％，因此需要增加检测如抗PL-7和抗PL-12等自身抗体，利用多种指标相互配合以增加肌炎的检出率；2)不同疾病之间存在相互重叠的阳性抗核抗体，如抗dsDNA和抗Sm抗体为红斑狼疮的特异性标记物，但红斑狼疮患者血清亦常伴随出现阳性抗snRNP-A、-C及-68/70抗体；3)同一病患可出现多种风湿类疾病伴随出现的重叠病症，如10％的肌炎患者可检出阳性的抗PmScl抗体，其中一半患者多伴有硬皮病发生，而红斑狼疮患者常伴有继发性干燥综合征，因此检出阳性抗SSA(Ro52/Ro60)和抗SSB抗体可有效提示继发性干燥综合征的发生；4)某些检测指标可对病程发展有提示作用，如阳性抗snRNP类抗体的出现，则提示未来可能发生肺动脉高压的风险。虽然临床检验领域已经有少数可本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗原固定化基质膜，其特征在于，包含但不仅包含以下22条彼此独立的抗原检测线，所述的抗原检测线由双链DNA、组蛋白、核糖体P0蛋白、PCNA、SmD1、SmD3、SmB/B’、snRNP‑A、snRNP‑C、snRNP68/70、SSA/Ro60、SSA/Ro52、SSB/La、Jo‑1、PL‑7、PL‑12、PmScl、Scl‑70、CENP‑A、CENP‑B、RA33以及PR3组成。

【技术特征摘要】
2018.04.01 CN 20181027979291.一种抗原固定化基质膜，其特征在于，包含但不仅包含以下22条彼此独立的抗原检测线，所述的抗原检测线由双链DNA、组蛋白、核糖体P0蛋白、PCNA、SmD1、SmD3、SmB/B’、snRNP-A、snRNP-C、snRNP68/70、SSA/Ro60、SSA/Ro52、SSB/La、Jo-1、PL-7、PL-12、PmScl、Scl-70、CENP-A、CENP-B、RA33以及PR3组成。2.如权利要求1所述的抗原固定化基质膜，其特征在于，所述抗原固定化基质膜为硝酸纤维膜或尼龙膜；所述抗原检测线平行设置；和/或，所述组蛋白、所述核糖体P0蛋白、所述snRNP68/70、所述PCNA、所述SmD1、所述SmD3、所述SmB/B’、所述snRNP-A、所述snRNP-C、所述SSA/Ro52、所述SSB/La、所述Jo-1、所述PL-7、所述PL-12、所述Scl-70、所述CENP-A、所述CENP-B、所述SSA/Ro60、所述PmScl-75、所述RA33及所述PR3是利用哺乳动物细胞系统表达获得，所述哺乳动物细胞为HEK293细胞。3.一种检测自身免疫疾病相关抗核抗体谱的试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求1或2所述的抗原固定化基质膜。4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的抗原固定化基质膜为免疫印迹法用抗原固定化基质膜；较佳地，所述的试剂盒还包括用于固定所述抗原固定化基质膜的支撑载体、酶联试剂、显色底物、样本稀释液、浓缩洗涤液和反应终止液，所述支撑载体与所述抗原固定化基质膜组成反应膜条。5.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，抗原固定化基质...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐爱民，钟铃，韩灏，凯·基恩，周鹏程，左陪军，
申请(专利权)人：英诺诊断有限公司，
类型：发明
国别省市：中国香港,81