【技术实现步骤摘要】
ATP生物荧光lgCA-lgIA标准曲线法检测抗菌涂料抗细菌性能的方法
本专利技术涉及抗菌涂料的抗细菌性能测试方法，具体是一种应用ATP荧光光度计对以抗菌率R或抗菌活性值A表征的抗菌涂料抗细菌性能进行精准定量检测的ATP生物荧光lgCA-lgIA标准曲线法，属于涂料抗菌功能检测
技术介绍
伴随着人们生活水平的提高和健康意识的增强，室内环境及家居装修质量备受关注，抗菌涂料因此应运而生且供不应求；据统计，2017年全球抗菌涂料产量已逾40万吨；相关机构ZionResearch最新研究报告显示，2020年国际抗菌涂料市场预计将突破50亿美元，复合年平均增长率为9％。可见抗菌技术在涂料产业的应用和普及势不可挡，抗菌功能已成为涂料产品极具特色的一个“卖点”；但现有检测技术的滞后却严重制约着产业发展。目前，国内外抗菌材料性能检测技术体系主要针对细菌和真菌，各国抗细菌性能测试方法原理多基于对细菌进行分离培养的平板计数法，一是日本工业标准提出的贴膜培养和浸渍定量试验方法；二是源自美国纺织业的抑菌环法；三是国际通用的振荡烧瓶法；四是源于美国纺织企业的滴下法；五是日本企业针对光催化型抗菌制品研发的盖玻片法。迄今为止，虽然我国已颁布实施GB/T21866-2008《抗菌涂料(漆膜)抗菌性测定法和抗菌效果》，但现有检测方法在
技术实现思路
和实际应用中存在以下共性问题：一是所涉实验菌种过少，难以满足企业与时俱进的新品研发与质控需求；二是实验过程繁琐，相关操作受实验员专业经验影响，测试误差大，缺乏可比性；三是测试周期在48小时～72小时之间，时间及经济成本高。近年来，在国际细菌检...
【技术保护点】
1.一种抗菌涂料抗细菌性能的检测方法，包括：(1)样品提取、制备及前处理；(2)设备选型及试剂、培养基配制；(3)菌种保藏、活化及菌悬液制备；(4)ATP浓度对数值lgCA‑相对荧光强度对数值lgIA标准曲线建立及接种菌液活菌ATP浓度CA标定；(5)样品接种、培养及洗脱回收；(6)回收液相对荧光强度值IA测定；(7)回收液活菌ATP浓度CA和TA推算以及抗菌率R和抗菌活性值A计算；(8)结果评价；其特征在于，应用ATP荧光光度计对以抗菌率R或抗菌活性值A表征的抗菌涂料抗细菌性能进行精准定量测试的ATP生物荧光lgCA‑lgIA标准曲线法，具体的：在回收液相对荧光强度值IA测定中：明确涂料样品提取以及对照样品和抗菌样品的制备、数量、尺寸、前处理等要求，将试验标准菌株进行传代、活化后，取连续转接2次的新鲜细菌培养物制备菌悬液并对其菌数进行初筛，用试验菌种培养液将1.0×10
【技术特征摘要】
1.一种抗菌涂料抗细菌性能的检测方法，包括：(1)样品提取、制备及前处理；(2)设备选型及试剂、培养基配制；(3)菌种保藏、活化及菌悬液制备；(4)ATP浓度对数值lgCA-相对荧光强度对数值lgIA标准曲线建立及接种菌液活菌ATP浓度CA标定；(5)样品接种、培养及洗脱回收；(6)回收液相对荧光强度值IA测定；(7)回收液活菌ATP浓度CA和TA推算以及抗菌率R和抗菌活性值A计算；(8)结果评价；其特征在于，应用ATP荧光光度计对以抗菌率R或抗菌活性值A表征的抗菌涂料抗细菌性能进行精准定量测试的ATP生物荧光lgCA-lgIA标准曲线法，具体的：在回收液相对荧光强度值IA测定中：明确涂料样品提取以及对照样品和抗菌样品的制备、数量、尺寸、前处理等要求，将试验标准菌株进行传代、活化后，取连续转接2次的新鲜细菌培养物制备菌悬液并对其菌数进行初筛，用试验菌种培养液将1.0×10-3mol/L的ATP标准原液稀释为高、低浓度标准系列溶液：7.0×10-9mol/L、7.0×10-8mol/L、7.0×10-7mol/L(如果仪器检测上限无法达到10-7mol/L量级或高浓度标准曲线的线性较差，可将其ATP浓度系列改为7.0×10-10mol/L、7.0×10-9mol/L、7.0×10-8mol/L)和4.2×10-11mol/L、4.2×10-10mol/L、4.2×10-9mol/L，并测定其相对荧光强度值IA；绘制两条相应浓度的lgCA-lgIA标准曲线，推导得出曲线方程式Y＝aA0X+bA0(高浓度)、Y＝aAX+bA(低浓度)和线性相关系数RA02(高浓度)、RA2(低浓度)，对细菌总量为6.0×108CFU/mL的菌悬液进行10倍梯度稀释后，测定其相对荧光强度值IA，根据高浓度标准曲线方程式Y＝aA0X+bA0推算相应的活菌ATP浓度CA；经调整得到CA范围为5.0×10-8mol/L～9.0×10-8mol/L的接种菌液，然后，向各组对照样品和抗菌样品待测表面分别滴加0.3mL菌液，立即用4.7mL洗脱液对6组0h接触样品进行洗脱回收；应用ATP荧光光度计测定回收液的相对荧光强度值IAC0ij、IAT0ij，根据低浓度标准曲线方程式Y＝aAX+bA推算其活菌ATP浓度CAOij和TAOij，同时，将6组24h接触样品密封于无菌平皿内，(37±1)℃、(90±2)％RH培养24h±2h后；采用与0h接触样品相同的方式回收表面残留菌并测定其回收液的相对荧光强度值IACtij、IATtij，推算相应的活菌ATP浓度CAtij和TAtij；在抗菌率R及抗菌活性值A计算中：根据ATP低浓度标准曲线lgCA-lgIA的线性方程式Y＝aAX+bA，以0h接触及24h培养后每件对照样品和抗菌样品回收液的相对荧光强度测定值和作为基础数据；在试验有效条件下，计算其经24h培养后的细菌增长值Fij、Gij以及抗菌率Rij和抗菌活性值Aij；对每组样品的Rij和Aij取算术平均值得到相应的Ri和Ai；每批抗菌涂料样品的抗菌率R和抗菌活性值A为其三组样品Ri和Ai的算术平均值；并明确相关数据修约和测量不确定度要求；在结果评价中：参考卫生行业通用做法和相关抗菌产品标准要求，确定抗细菌性能分级判定标准；当某组(件)抗菌涂料样品的抗菌率Ri(Rij)或抗菌活性值Ai(Aij)与其他两组(四件)样品的抗细菌性能相比至少相差一个水平级时，重新提取一组(件)样品重复实验；计算其经ATP生物荧光lgCA─lgIA标准曲线法测得的抗菌率或抗菌活性值，如果前后两组(件)抗菌涂料样品抗细菌性能水平相同，则弃之；取另外两组(四件)剩余样品抗菌率Ri(Rij)或抗菌活性值Ai(Aij)的算术平均值作为该批次(组)抗菌涂料样品抗细菌性能的评价结果。2.根据权利要求1所述的抗菌涂料抗细菌性能的检测方法，其特征在于，所述的样品提取、制备及前处理，按下述步骤进行：(1)涂料样品提取：本专利方法所涉涂料样品为建筑和木器用抗菌涂料，包括液态或加热时可液化但不发生化学变化以及粉状、粒状、膏状的色漆和清漆物料；取样地点涵盖罐、柱状桶、贮槽、集装箱、槽车/槽船以及鼓状桶、袋、大包、贮仓、贮仓车或传送带等场所，取样由具备相关经验人员参照GB/T3186-2006《色漆、清漆和色漆与清漆用原材料取样》中有关规定，根据待测涂料类别、聚集状态及容器大小，选择适用类型和规格的清洁器具提取至少2kg或抗菌试验所需量3～4倍的样品，当涂料存放于鼓状桶、柱状桶、袋等小容器时，如果交付批存在若干个容器，取样数量遵循GB/T3186中表1的规定，否则从每个容器中各提取一件样品；若交付批由不同生产批容器组成，则从每个生产批容器中分别提取，当涂料存放于贮槽、公路槽车、贮仓、贮仓车、铁路槽车、槽船或平均高度至少1m的反应器等大容器时，对于均匀物料及搅拌或加热后可成为均匀物料的暂时性不均匀物料，上部样品可用取样勺或取样管提取，中部样品用浸人式罐提取，距液面十分之九深度处的底部样品用浸人式罐或区域取样器提取；如果大容器由几个隔段组成，从每个隔段中至少提取一件样品，并将所取单一样品混合成一件平均样品，对于永久性不均匀物料，至少提取2件样品，其中上层样品可用取样勺、下层样品用区域取样器、浸人式瓶(罐)或在容器底阀处取样；制备样品时将所取两层样品按照产品标准规定的配比称量混合成1件平均样品；取样结束后，使用旋转分样器将所提取的全部固、液体涂料样品充分混匀并分成15等分；其中固体样品每份500g，液体样品每份400mL，然后，将每份涂料样品分别放入带螺旋盖的罐、瓶、桶或塑料袋等容器中存放，其中金属容器配有密封金属盖，无焊料且内部不涂色漆和清漆(不用镀锌和铝质容器)；玻璃容器配有密封盖；(2)对照样品：除未添加任何抗菌防腐防霉成分外，对照样品的涂料类别、底板材质及制备方法、规格尺寸、试板厚度等均与抗菌样品完全相同，每个菌种试验使用6组样品；其中0h接触和24h培养试验各用3组，每组5件样品；(3)抗菌样品：添加抗菌成分的涂料试板，根据待测涂料样品的实际应用情况，可选择石棉水泥板、木质板、金属板、塑料板、玻璃板、贴膜纸板等底材；试板尺寸为(50±1)mm×(50±1)mm；其中钢板、铝板、马口铁板等金属试板厚度为1mm，木质试板厚度不大于10mm，矿石建筑板、石棉水泥板、复合木板、玻璃等材质试板厚度为1mm～10mm，所用试板表面平整、无锈、无油污，金属试板表面经磨砂纸打磨粗糙后，用75％的乙醇溶液擦拭2min；木质面板不取木心材且无树节，烘干后使用；按照GB/T1727-1992《漆膜一般制备法》要求制作漆膜，涂料施涂包括两次涂刷过程，第一次表干后再涂刷第二次，漆膜总厚度(湿膜)小于100μm；若以木板或纸板为底材，应确保漆膜封住整个木板，抗菌样品数量与对照样品相同，每组待测样品选择一组对照样品作为参照物并有效标识；(4)样品前处理：试板涂刷后置于(23±2)℃、(50±5)％RH的洁净环境中，彼此间距至少20mm；避免日光直射，自然状态下调节7d，直至试板涂膜完全干燥，试验前将各组对照样品和抗菌样品置于超净工作台上，紫外灭菌消毒5min；然后将其待测表面向上放入无菌平皿内，备用。3.根据权利要求1所述的抗菌涂料抗细菌性能的检测方法，其特征在于，所述的设备选型及试剂、培养基配制，按下述步骤进行：(1)通用要求：试验用分析纯试剂及符合GB/T6682-2008规定的三级水(蒸馏水或去离子水)，实验室具备二级生物安全资质，人员具有正规微生物实验室工作经验；(2)仪器设备：洁净等级不低于100的超净工作台；含ATP荧光光度计、配套试剂盒、专用试管等的ATP生物荧光快速检测系统，其中ATP荧光光度计波长量程300nm～650nm，ATP浓度检测范围10-13mol/L～10-7mol/L；(20～50)℃±1℃、(50～95)％RH±2％RH的恒温恒湿培养箱；(121±2)℃、(103±5)kPa的压力蒸汽灭菌器；-20℃～-70℃的低温冰箱；0℃～8℃的冷藏箱；感量0.001g的电子天平；频率范围(30～50)kHz的超声波清洗器；转速范围(500～3000)r/min的旋涡振荡器；分样比率≥1:15的旋转分样器；精度±0.1(25℃)的pH计；电炉；(3)材料器具：1mL、10mL的无菌刻度吸管；0.05mL、0.1mL、0.2mL、1mL、5mL、10mL(计量误差小于1％)的单道可变量程移液枪和无菌移液枪头；容量250mL、500mL的无菌锥形瓶；直径90mm的无菌培养皿；麦氏细菌标准比浊管及配套试管；无菌试管；直径不大于4mm的接种环；L棒；酒精灯；灭菌镊子；医用胶带；酒精棉球(75％)；分度值1mm的直尺；分度值0.01mm的千分尺；的温度计；的湿度计；精度0.01s的秒表；A6白色复印纸；0.7mm芯黑色中性笔；宽的漆刷或喷嘴内径的喷枪；适用的涂料取样器及存放容器；(4)试剂：75％的乙醇溶液；85％的生理盐水(121℃高压灭菌15min，5℃～10℃存放30d)；(5)培养基/液(可用市售培养基/液)：所配培养基/液分装后经121℃高压灭菌15min，2℃～8℃存放30d；营养琼脂(NA)：将5g牛肉膏、10g蛋白胨、5g氯化钠、15g琼脂加热溶解于1000mL水中，调节pH至7.0～7.2；营养肉汤(NB)：将3g牛肉膏、10g蛋白胨、5g氯化钠加热溶解于1000mL水中，调节pH至7.0～7.2；沙门氏菌保藏用脑心浸出液肉汤(BHI)：将10g蛋白胨、5g氯化钠、2.5g磷酸氢二钠、2g葡萄糖加热溶解于500mL牛心浸出液中，调节pH至7.4±0.2；大肠埃希氏菌及志贺氏菌/金黄色葡萄球菌及沙门氏菌的培养液：将1:500/1:100的营养肉汤(NB)与85％的无菌生理盐水溶液混合，调节pH至7.0～7.2；(6)ATP荧光反应试剂(或用市售试剂)：除磷酸盐缓冲溶液外，所配ATP荧光反应试剂-20℃～-70℃保存，6个月内使用；稀释缓冲溶液：0.005mol/L且含0.037％蔗糖的磷酸氢二钠溶液，调节pH至7.2±0.2；121℃高压灭菌15min，2℃～8℃存放30d；ATP标准试剂原液：将60.5mg三磷酸腺苷二钠(C10H14O13P3Na2·3H2O)溶解于100mL水中，配制成浓度为1×10-3mol/L的溶液，-20℃冷冻密封保存6个月；ATP荧光试剂缓冲溶液：将1117mg三羟甲基氨基甲烷、183mg乙二胺四乙酸二钠、808mg乙酸镁、6.7mg二巯基苏糖醇、25000mg的β-环糊精和925mg葡萄糖加热溶解于250mL水中，调节pH至7.5±0.2；8h内使用；ATP裂解液：将4.6国际单位/ml的三磷酸腺苷双磷酸酶(EC:3.6.1.5)和46国际单位/ml的磷酸腺苷脱氨酶(EC:3.5.4.6或EC:3.5.4.17)、37mg蔗糖、20mg牛血清蛋白溶解于10mL浓度为0.05mol/L的2-吗啉乙磺酸缓冲溶液中，调节pH至6.0±0.5，8h内使用(1mL裂解液在15min内可将营养肉汤中的ATP浓度降至10-13mol/L以下)；ATP提取液：将45mg三羟甲基氨基甲烷加热溶解于9.8ml水中，与0.2ml浓度为10％的苯扎氯铵溶液混匀后，调节pH至12.0±0.5；ATP荧光试剂：将16mg荧光素酶(EC:1.13.12.7)、12.6mg的D-荧光素、56mg牛血清蛋白溶于30mL的ATP荧光试剂缓冲溶液中，混匀后室温静置15min，3h内使用。4.根据权利要求1所述的抗菌涂料抗细菌性能的检测方法，其特征在于，所述的菌种保藏、活化及菌悬液制备，按下述步骤进行：(1)试验菌种：大肠埃希氏菌ATCC8739；金黄色葡萄球菌ATCC6538；沙门氏菌ATCC14028；志贺氏菌CMCC51105(或由国家相应菌种保藏管理中心提供并可溯源的其他菌种)；(2)菌种保藏：以无菌操作打开冻干菌种管，用毛细吸管加入适量营养肉汤(沙门氏菌用BHI培养液)，吹吸数次使菌种融化分散，然后，将少许试验菌种悬浮液滴入装有5mL～10mL营养肉汤的试管中，(37±1)℃培养24h～48h；用作斜面保藏菌，(5±1)℃存放(不超过1个月)，接种次数不超过14代；(3)菌种活化：将斜面保藏菌转接营养琼脂斜面培养基，(37±1)℃培养18h～24h；每天转接1次，连续转接不超过15d，试验使用第3代～第14代且于24h内转接的新鲜细菌培养物；(4)菌悬液制备：用接种环从菌种活化培养基上刮取少量新鲜细菌，加入试验菌种培养液制成菌悬液；1000r/min振摇试管1min或以30cm摆幅振摇试管80次，确保细菌悬浮均匀，将适量菌悬液移至与麦氏标准比浊管配套的无菌试管中，用0.7mm芯黑色中性笔在A6白色复印纸上划3条长度为10cm的平行线；目测试管与标准比浊管(标称浓度6.0×108CFU/mL)的浊度差异，滴加培养液直至二者浊度相同为止。5.根据权利要求1所述的抗菌涂料抗细菌性能的检测方法，其特征在于，所述的ATP浓度对数值lgCA-相对荧光强度对数值lgIA标准曲线建立及接种菌液活菌ATP浓度CA标定，按下述步骤进行：(1)标准系列溶液确定和ATP生物荧光测试样制备：用试验菌种培养液将1.0×10-3mol/L的ATP标准原液稀释为高、低浓度标准系列溶液：7.0×10-9mol/L、7.0×10-8mol/L、7.0×10-7mol/L(如果仪器检测上限无法达到10-7mol/L量级或高浓度标准曲线的线性较差，可将其ATP浓度系列改为7.0×10-10mol/L、7.0×10-9mol/L、7.0×10-8mol/L)和4.2×10-11mol/L、4.2×10-10mol/L、4.2×10-9mol/L并混匀，然后，用灭菌移液枪将0.1mL的ATP标准系列溶液分别移至三只无菌试管中，依次滴加0.9mL含0.037％蔗糖的磷酸盐缓冲液并混匀；再将0.1mL不同浓度的混合溶液分别移至三支仪器专用无菌试管中，作为ATP生物荧光测试平行样；(2)相对荧光强度值IA测定：根据本专利中相对荧光强度值IA测定方法，以试验菌种培养液作为空白样液验证仪器及试剂组本底后；按照浓度从低到高的顺序，向不同浓度ATP标准溶液三个平行样中分别滴加0.1mL的ATP提取试剂，混匀后滴入0.1mL的ATP荧光试剂；再次混匀，立即用ATP荧光光度计测定其相对...
【专利技术属性】
技术研发人员：李文杰，贾月梅，崔宗岩，杨志伟，张进杰，
申请(专利权)人：秦皇岛出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：河北,13
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