单分子水平的蛋白质-蛋白质相互作用的测量制造技术

提供了用于表征至少一种蛋白质分子与可检测标记的探针的结合特征的方法。

Measurement of Protein-Protein Interaction at Single Molecular Level

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】单分子水平的蛋白质-蛋白质相互作用的测量相关专利申请的交叉引用本申请要求2017年1月30日提交的美国临时专利申请号62/452,231的优先权，该申请通过引用纳入本文用于所有目的。背景免疫测定是广泛采用的方法，用于确定生物样品和其他样品中分子的数量和/或存在。这些方法依赖于抗体和抗原之间的高度选择性相互作用。免疫测定的灵敏度是良好测定的关键性能指标，其受到测定平台的恒定和可变噪音源的影响。由检测元件，信号处理，分子散粒噪音，热噪音和约翰逊噪音引起的恒定噪音源将通过特定系统在特定强度下的任何测量来呈现(Woolley等，2015，AnalBioanalChem407：8605-8615)。然而，采用能够进行常规单分子检测的改进检测技术，检测抗体-抗原结合的仪器不再是定义免疫测定检测限的基本因素。可变噪音主要来自抗体的非特异性结合，其在免疫复合物形成的每个步骤中发生，具有不同的影响。虽然非靶物质的结合可能性低于分析物的特异性结合，但在低浓度的情况下，非特异性结合占整体信号的大部分(Jackson和Ekins，1986，JImmunologicalmethods，87：13-20；Hassibi等，2007，JAppliedPhysics，102；Rissin等，2010NatureBiotechnology28：595-599；Schmidt等，2011JProteomeResearch10：1316-1322；Chang等，2012，Jimmunologicalmethods378：102-115)。免疫测定通常限于通过非特异性结合效应在纳摩尔至皮摩尔范围内的定量。大多数市售可得的免疫测定依赖于将化学连接的荧光团用于抗体。将与测定平台结合的所有抗体的荧光强度(无论是通过特异性还是非特异性结合)经平均并求和处理以产生抗原浓度的估计值。减少非特异性结合噪音的最有效方法是使用高度特异性和高亲和力的抗体，使用阻断剂，并尽可能多地洗去非特异性结合的抗体。现有技术的局限性在于它不能使用低亲和力或快解离速率的探针来研究单分子水平下的蛋白质-蛋白质相互作用。由于需要增强的灵敏度和特异度，需要补足或补充现有工具，例如表面等离子体共振(SPR)，2-D凝胶电泳和质谱(MS)。专利技术概述本专利技术提供了表征生物分子如蛋白质，以及检测单分子水平的结合对成员之间的结合特征的方法。其中，这些方法提供了区分探针与其抗原的特异性结合和探针与任何非靶抗原分子的非特异性结合的解决方案。在一个实施方式中，一种表征至少一种蛋白质分子与可检测标记的探针的结合特征的方法，该方法包括：使蛋白质分子与可检测标记的探针接触，该探针显示出与蛋白质相关的快速解离速率结合特征，以在蛋白质分子和探针之间产生瞬时结合相互作用；通过对多个位置处的标记的探针进行单分子检测来检测瞬时相互作用，其中瞬时相互作用具有约10分钟至约1纳秒的观察到的停留时间；并且关联多个位置处的多个瞬时相互作用的相互作用频率，以确定蛋白质分子与探针的结合特征。在一个实施方式中，蛋白质固定在表面上。在一个实施方式中，固定的表面是玻璃，石英或塑料。在一个实施方式中，使用亲水性自组装单层，亲水性聚合物刷，两性离子聚合物刷或腈涂层将蛋白质固定在表面上。在一个实施方式中，表面用链霉亲和素包被，并且蛋白质使用生物素化的蛋白质而被固定在表面上。在一个实施方式中，蛋白质以约2个分子至约1×106个分子/100μm2的表面密度固定。在一个实施方式中，蛋白质以约2×102个分子至约8×105个分子/100μm2的表面密度固定。在一个实施方式中，蛋白质以约2×103个分子至约6×104个分子/100μm2的表面密度固定。在一个实施方式中，使多个位置处的多个瞬时相互作用的相互作用频率相关联允许分离蛋白质特异性信号与非特异性噪音。在一个实施方式中，蛋白质特异性信号相互作用与非特异性噪音相互作用的比率大于或约为2。在一个实施方式中，蛋白质特异性信号相互作用与非特异性噪音相互作用的比率大于或约为3。在一个实施方式中，蛋白质特异性信号相互作用与非特异性噪音相互作用的比率大于或约为4。在一个实施方式中，关联多个位置处的多个瞬态相互作用的相互作用频率测量多个位置处的结合事件(on-event)和解离事件(off-event)的总数。在一个实施方式中，每个观察区域记录超过1000个瞬时相互作用。在一个实施方式中，每个观察区域记录超过2000个瞬时相互作用。在一个实施方式中，每个观察区域记录超过4000个瞬时相互作用。在一个实施方式中，结合特征包括从多个位置处的蛋白质分子和探针之间的多个瞬时相互作用计算的统计度量。在一个实施方式中，统计度量是由泊松统计，隐马尔可夫建模或边缘检测算法计算的。在一个实施方式中，统计度量包括以下的一个或多个：a.测定的多个位置处的蛋白质分子与探针的重复结合的停留时间分布的平均值；b.测定的多个位置处的蛋白质分子与探针的重复结合的停留时间分布的中值；c.测定的多个位置处的蛋白质分子与探针的重复结合的停留时间分布的标准偏差；d.测定的多个位置处的蛋白质分子与探针的重复结合的停留时间分布的峰值；e.测定的多个位置处的蛋白质分子与探针的重复结合的停留时间分布的形态；f.测定的多个位置处的蛋白质分子与探针的重复结合的瞬时事件数量分布的平均值；g.测定的多个位置处的蛋白质分子与探针的重复结合的瞬时事件数量分布的中值；h.测定的多个位置处的蛋白质分子与探针的重复结合的瞬时事件数量分布的标准偏差；i.测定的多个位置处的蛋白质分子与探针的重复结合的瞬时事件数量分布的峰值；或j.测定的多个位置处的蛋白质分子与探针的重复结合的瞬时事件数量分布的形态。附图说明图1(A)显示IL-6抗体通过非特异性结合与点相互作用的热力学曲线。该点抗体的结合和解离事件总数为6。图1(B)显示了IL-6抗体与表面上的IL-6分子相互作用的热力学曲线。该点上抗体的结合和解离事件总数为24，显著高于非特异性点的数量。在图1(C)中，IL-6抗体与测定表面上的总共2900个单独位置相互作用并产生2900个单独的热力学曲线。其中，2500个曲线(非特异性结合群)显示IL-6抗体与它们相互作用的可能性低。对于这些点，总共观察到2-10个结合和解离事件。对于400个点的其余部分(特异性结合群体)，IL-6抗体主动寻求与它们的相互作用，这通过总共20-24个结合和解离事件来证明。该结果显示在测定表面上检测到400个靶分子。专利技术详述I.概念在识别的讨论中经常出现两个术语。特异性度量免疫系统在不同抗原之间的区分程度。交叉反应性度量不同抗原对免疫系统而言的相似程度。特异性定义了免疫识别的另一个维度。特异性是免疫应答在抗原变体之间的区分程度。一种简单的方法测量纯化的抗体或T细胞受体对不同抗原的相对结合亲和力。当在中等严谨性下测量时，较低亲和力的结合通常可提供更高的特异性。这是因为低亲和力受体结合较少种类的抗原，因为条件限制了测定对低亲和力结合的灵敏度。因此，不同抗体或T细胞的相对特异性取决于亲和力和测量条件。抗原与其抗体的结合特性及其对解离速率与总解离时间的影响如下所示。因此，不希望受理论束缚，据信快速解离速率抗体(或其他合适的结合伴侣)在这些应用中可能比本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于表征至少一种蛋白质分子与可检测标记的探针的结合特征的方法，所述方法包括：a.使蛋白质分子与可检测标记的探针接触，所述探针显示出与蛋白质相关的快速解离速率结合特征，以在蛋白质分子和探针之间产生瞬时结合相互作用；b.通过对多个位置处的标记的探针进行单分子检测来检测瞬时相互作用，其中所述瞬时相互作用具有约10分钟至约1纳秒的观察到的停留时间；并且c.关联多个位置处的多个瞬时相互作用的相互作用频率，以确定蛋白质分子与探针的结合特征。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2017.01.30 US 62/452,2311.一种用于表征至少一种蛋白质分子与可检测标记的探针的结合特征的方法，所述方法包括：a.使蛋白质分子与可检测标记的探针接触，所述探针显示出与蛋白质相关的快速解离速率结合特征，以在蛋白质分子和探针之间产生瞬时结合相互作用；b.通过对多个位置处的标记的探针进行单分子检测来检测瞬时相互作用，其中所述瞬时相互作用具有约10分钟至约1纳秒的观察到的停留时间；并且c.关联多个位置处的多个瞬时相互作用的相互作用频率，以确定蛋白质分子与探针的结合特征。2.如权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质固定在表面上。3.如权利要求2所述的方法，其中固定的表面是玻璃、石英或塑料。4.如权利要求3所述的方法，其中使用亲水性自组装单层，亲水性聚合物刷，两性离子聚合物刷或腈涂层将蛋白质固定在表面上。5.如权利要求3所述的方法，其中所述表面用链霉亲和素包被，并且所述蛋白质使用生物素化的蛋白质被固定在表面上。6.如权利要求2所述的方法，其中所述蛋白质以约2个分子至约1×106个分子/100μm2的表面密度固定。7.如权利要求5所述的方法，其中所述蛋白质以约2×102个分子至约8×105个分子/100μm2的表面密度固定。8.如权利要求6所述的方法，其中所述蛋白质以约2×103个分子至约6×104个分子/100μm2的表面密度固定。9.如权利要求1所述的方法，其中使多个位置处的多个瞬时相互作用的相互作用频率相关联允许分离蛋白质特异性信号与非特异性噪音。10.如权利要求9所述的方法，其中蛋白质特异性信号相互作用与非特异性噪音相互作用的比率大于或约为2。11.如权利要求10所述的方法，其中蛋白质特异性信号相互作用与非特异性噪音相...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘宁，
申请(专利权)人：生物辐射实验室股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US